关于透射电镜和扫描电镜等的样品制备课件.ppt

第五章第五章 透射电子显微镜的透射电子显微镜的 样品制备技术样品制备技术5.1 TEM对样品的基本要求制备原因要求措施放大倍数100万倍，铜网直径3mm脱水、固定时易浸透 取材小取材小样品品电子束打击样品易变形样品结实固定、包埋固定、包埋高真空（电子束、穿透能力） 样品在真空状态下无挥发物脱水脱水电子束穿透能力弱样品切片厚度样品切片厚度﹤100nm超薄切片超薄切片样品组成元素原子序数小、图像反差小 增加反差重金属染色重金属染色 根据样品的种类、性质和分析要求选用不同的制备方法，有以下三种方法：• 支支 持持 膜膜 法法• 复复 型型 法法• 薄薄 膜膜 法法5.2 TEM样品的制备方法5.2.1支持膜法支持膜法•悬悬浮浮液液、、粉粉体体等等细细小小试试样样需要捞在覆有薄膜的金属载网上经干燥后进行观察具体操作在铜网上覆盖支持膜，将经过超声波分散超声波分散的颗粒悬浮液滴在支持膜上，静置干燥，或用红外灯烘烤干燥 制作载网的材料大多是铜，因此习惯上将载网称为铜网，不过制作载网的材料还可以是金、银、镍、铝、铂及尼龙载网的大小随电镜的需要而不同，一般直径为3mm。

网孔的形状有圆形、方形、单孔形等，网孔有50、100、200、300及400目等多种规格常用一般普通组织超薄切片选用200-300目的载网，对于过小的和过碎的样品，可选用400目的载网；对于不易查找的样品，可选用带字母标记的载网载网类型载网类型 带字母的载网 400目平行载网•载网的数目再高也是有空隙的，为了防止极微小的样品在捞片时漏掉；或切片时在电子束的轰击下卷曲；或为了加强空隙大的载网的支持作用等，需要在载网上覆盖上一层支持膜制作支持膜所选的材料要求透透明明、本本身身在在电电镜镜下下无无可可见见的的结结构构以及在电电子子束束轰轰击击下下有高度的机械稳定性有高度的机械稳定性3个基本的条件•有多种支持膜，较常用的有孚尔瓦膜、碳膜、火棉胶膜等孚尔瓦膜一般制成20nm左右，它的支持力较强，但制备较复杂碳膜只需几个纳米厚，它的特点是分辨力高，化学性能稳定，机械强度也高，常用于加固其它膜火棉胶膜的机械强度较孚尔瓦膜小，但容易制备，所以也较常用 介绍一下Formvar膜的制法：该膜的化学成分为聚乙烯醇缩甲醛（Polyvinyl formal，简称PVF）。

首先制备02.-0.5%的氯仿（或二氯乙烯）溶液，然后用洗净的干燥的载玻片伸入到该溶液中停留片刻，平稳取出，自然干燥后玻片上形成一层薄膜 再用刀片沿玻片边缘将膜划破，继将该玻片的一端垂直浸入玻璃平皿的蒸馏水中，待玻片上的薄膜完全漂在水面，把玻片轻轻下压取出 再将铜网排列在膜上，用滤纸与铜网完全贴附后，用镊子夹住滤纸的一角轻轻将其取出放于培养皿中，待自然干燥后就使用了 Formvar支持膜的制备支持膜的制备 在使用之前，新网和旧网都需要进行清洗，清洗的目的除了使载网清洁之外，还有除去载网的静电以便捞片的作用对于新的载网，直接用95％的乙醇浸泡一下，再用重蒸水冲洗后自然晾干即可旧载网的清洗方法有以下两种：•氯仿法：把旧网放入锥形瓶中，用氯仿浸泡若干天，经常晃动帮助残存的样品从载网上脱落，接着用重蒸水冲洗数次，再用100％乙醇洗一次后，放在垫有滤纸的培养皿中自然晾干•烧灼法：用95％的乙醇烧灼片刻后放入其中，最后用重蒸水冲洗数次，最后一次用100％乙醇，捞出后自然晾干•由于电子束穿透能力很低，因此要求所观察的样品很薄，对于常用的75-200kv加速电压来说，样品厚度控制在100-200nm为宜。

对对于于那那些些易易起起变变化化或或难难以以制制成成电电子子束束透透明明的的薄薄膜膜试试样样采采用用复复型型法法制制备备样样品品复型法是用中间媒介物（碳、塑料薄膜）把固体样品表面微观形貌浮雕复制到薄膜上，利用透射电子的质厚衬度效应，通过对浮雕的观察，间接地得到材料表面组织形貌复型法得到的样品是一种间接试样 它只能用于试样表面形貌的观察和研究，而不能用来观察试样的内部结构5.2.2 复型法•对复型材料的主要要求：•①复型材料本身必须是“无结构”或非晶态的；•②有足够的强度和刚度，良好的导电、导热和耐电子束轰击性能复型的种类复型的种类•按复型的制备方法，复型主要分为：• 一级复型• 二级复型• 萃取复型（半直接样品） 碳一级复型•（1）用常规方法将试样的表面抛光、腐蚀，其腐蚀深度较一般金相腐蚀略深断口最好为新鲜断口•（2）在真空镀膜仪中将试样表面喷镀一层碳膜，厚度控制在10~20nm•（3）用刀片或针尖将碳膜表面划成3×3mm的小方块•（4）将试样在专用的电解液中进行电解当碳膜的边角翘起或有个别碳膜脱落时，取出试样并放到无水乙醇溶液中轻轻晃动，使碳膜脱落。

•（5）再用无水乙醇或水将碳膜轻轻漂洗2~3次，再在溶液中停留几分钟，将电解液彻底清除干净•（6）用铜网捞出晾干即可碳一级复型示意图二级复型•（1）用常规方法将试样表面抛光、腐蚀，其腐蚀深度较一般金相腐蚀略深•（2）配制好0.5%、1%、2%、5%几种不同浓度的火棉胶醋酸异戊脂溶液•（3）取0.5%的火棉胶溶液均匀地涂于试样表面，用红外灯烤干，依次用同样的方法将1%、2%或5%的火棉胶溶液涂于试样表面，并烤干•（4）用透明胶带紧贴火棉胶面，不能有气泡，小心地将胶带与复型膜一同揭下来，让复型膜面朝上，将胶带固定在载玻片上，做好标记•（5）用真空镀膜仪在复型膜面上蒸发上10~20nm厚的碳膜•（6）用尖刀将想要观察部分剪成略小于φ3mm铜网的小方块，放入二甲苯溶液中，浸泡1小时使胶带与复型膜分离•（7）用铜网将与胶带分离的复型膜捞到醋酸异戊脂溶液中溶掉火棉胶•（8）待火棉胶完全溶解后，用φ3mm铜网捞出，晾干萃取复型•定义：萃取复型是样品制备中最重要的进展之一，其目的在于如实地复制样品表面的形貌，同时又把细小的第二相颗粒（如金属间化合物、碳化物和非金属夹杂物等）从腐蚀的金属表面萃取出来，嵌在复型中，被萃取的细小颗粒的分布与它们原来在样品中的分布完全相同，因而复型材料就提供了一个与基体结构一样的复制品。

萃取出来的颗粒具有相当好的衬度，而且可以在电镜下做电子衍射分析•萃取复型选择的腐蚀剂要求能够腐蚀并显示基体组织形貌，但不能与萃取相发生化学反应，其腐蚀深度也较普通复型样品的腐蚀深度要深些碳萃取复型方法•按照一般金相试样的要求对试样磨削、抛光•选择适当的浸蚀剂进行深腐蚀，这种浸蚀剂既能溶去基体而又不会腐蚀第二相颗粒•将试样认真清洗以除去腐蚀产物•将试样放入真空镀膜机中喷碳，喷碳时转动试样以使碳复型致密地包住析出物或夹杂物•选择适当的电解液进行电解脱膜，电解脱膜时电流密度要适当，电流过大形成大量的气泡会使碳复型膜碎裂，电流过小则长时间脱不掉碳膜，适当的电流要通过试验确定•将脱下的碳膜捞入新鲜电解液中停留10min左右，以溶掉帖在碳膜上的腐蚀产物•将碳膜捞入酒精中清洗，最后用铜网捞起放到滤纸上干燥待观察萃取复型示意图5.2.3薄 膜 法 薄薄 膜膜 法法：不仅可得到高分辨率图像，显示试样内部十分细小的组织形貌衬度，还可以获得许多与试样晶体结构有关的信息（如点阵类型、位向关系、缺陷组态等）A 金属样品：双喷电解减薄法、离子减薄法B 无机非金属材料和导体矿物质：离子减薄法C 高分子材料和生物试样：超薄切片法5.2.3.1 金属薄膜样品的制备 目前较普遍地被采用的金属薄膜制备过程大体是： 线切割----机械研磨（或化学抛光）----化学抛光----电解抛光。

具体方法如下：1.线线切切割割：用线切割机床从大块样品上切下0.2-0.3mm厚的薄片，一般多切几片备用2.机机械械研研磨磨预预减减薄薄：机械研磨方法与金相试样抛光过程基本一致，其目的是将线切割留下的凹凸不平的表面抛光并预减薄至100μm左右机械研磨具有快速和易于控制厚度的优点，但难免产生应变损伤和样品升温，因此，减薄厚度不应小于100μm，否则其损伤层将贯穿薄片的全部深度• 简单的机械研磨可以产生大面积的薄区，但却使样品过于脆弱，很容易损坏，以我们的经验，一般Si材料可以平磨到50μm左右，对于脆性材料可适当增加厚度手工平磨时，应采用不断变换样品角度，或者沿“8”字轨迹的手法可以避免过早出现样品边缘倾角 如图示： P1500P20001μm金刚石膏金刚石膏 3.化学抛光预减薄化学抛光预减薄 化学抛光是一种快速的减薄过程抛光液一般包括三个基本成分，即硝酸或双氧水等强氧化剂用以氧化样品表面又以另一种酸溶解产生的氧化物层，此外还应含有粘滞剂以作为溶解下来的原子进行扩散的介质•4.双喷电解最终减薄双喷电解最终减薄•经过化学抛光预减薄的薄片可以冲成Ф3mm的小试样，剪成小块试样，然后将样品放入双喷电解抛光装置的喷嘴之间进行最终的减薄处理。

最后得到的是中心带有穿透小孔的薄片样品，将样品清洗干燥即可以直接在透射电镜下观察小孔周围的透明区域电解抛光的抛光液配法很多，最常用的是10％高氯酸酒精溶液. 双双喷喷电电解解减减薄薄工工作作原原理理：试样与铂丝导线保持接触作为阳极，电解液喷管中的一对铂丝作为阴极，喷管对准试样的中心电解液通过耐酸泵加压循环样品中心逐渐减薄，直至穿透洞口的边缘为透射电镜观察的区域，厚度小于200nm一般采用双喷或者离子减薄 这种方法主要用于金属和合金样品 离离子子减减薄薄仪仪的的工工作作原原理理：在电场作用下氩气被电离成带Ar+的氩离子，带着一定能量的氩离子从阳极飞向阴极，通过阴极孔，打在接地的样品表面，使样品表面溅射，这就是氩离子轰击的基本原理 这种方法对于陶瓷、金属等试样都可以适用，是一种普适的减薄方法 双喷电解抛光装置原理图双喷电解减薄仪离子减薄装置原理示意图金属与非金属薄膜制备工艺图金属与非金属薄膜制备工艺图500μm80μm3mm‹5μm2.5mm1. 1. 切割切割2. 2. 平面磨平面磨3. 3. 钉薄或预减薄钉薄或预减薄4. 4. 离子减薄或双喷电解减薄离子减薄或双喷电解减薄5.3 超薄切片的基本操作程序•超薄切片是生物样品制备方法中最基本、最常用的技术。

制备超薄切片的过程包括两个大的步骤：•第一步是制备组织包埋块；第一步是制备组织包埋块；•第二步是切块第二步是切块高分子生物医学材料超薄切片流程图5.3.1 取材 取材----按“快、冷、小、净、准”的原则，在尽可能短的时间内将≤1mm3的样品放入 固定液•快快 为了能观察到尽量接近生活状态时的生物组织或细胞结构，取材越快越好•冷冷 尽量保持低温下操作，使酶作用降低，减小对微细结构的影响•小小 取材时，动作要轻巧，刀片要锋利，组织块要≤ 1mm3 否则固定液穿透不良•净净 尽量少带血液或组织液进入固定液但切忌用水冲洗，可用缓冲液把表面血液或组织液冲掉•准准 取材的部位要准确电子显微镜的放大倍率很高，观察到的视野很小为了避免由于取材不准确而造成的一孔之见，要求取材要有一定的形态学实验基础•定定义义：指用物理的或化学的方法手段迅速地杀死细胞，使组织细胞的形态尽可能地保存在接近其生活时的状态•目的：目的：•1.防止组织细胞离体后变化，防止自溶，以保持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致•2.在固定以后的漂洗、脱水和包埋等样品处理过程中，保护样品使其物质不致溶解和流失•3.使组织适当的硬化为样品以后的处理做好准备。

•方法：方法： 有物理的和化学的固定法其中化学的方法是最常用的固定方法对于不同的样品材料，以及不同的实验目的应采取不同的固定方法5.3.2固定•化化学学固固定定，，是用化学试剂使各种结构成分形成不溶物，以免被水溶液与酯溶剂所提取组织块切小后，立即浸到大量固定液中一般使用青霉素小瓶，每瓶放10-20块组织，固定液2-4ml，置于4摄氏度固定2-4h或更长时间常用双重固定或多重固定一般常用的固定剂是戊二醛和锇酸一般常用醛类固定液做预固定，经过漂洗后再用四氧化锇固定液后固定，以提高固定效果•物物理理的的方方法法指用冷、热或微波等物理方法对生物组织进行固定，是化学固定的辅助方法冷冻固定和微波固定是较为常用的方法 1.四氧化锇和四氧化锇固定液四氧化锇和四氧化锇固定液 四氧化锇也被称为锇酸实际上它既非电解质，也不生成盐，是强氧化剂市售为安瓿状的微黄色结晶，挥发性强，有强烈的刺激性气味该试剂较贵重，0.5g或1g包装四氧化锇的毒性很强，它的蒸汽对眼角膜及鼻、喉粘膜具有毒性作用，使用时要注意防护作用，最好在通风橱内操作 四氧化锇固定液一般配置成2%的水溶液保存，临用时加等量的缓冲液稀释，使最终浓度为1%，锇酸不易溶解，配后要1-2天才能使用，而且应该避光，贮存在冰箱内。

水溶液应呈无色或淡黄色透明，若变成棕色则不能使用优点优点： 它能与不饱和脂肪酸结合形成脂肪-锇复合物固定脂类，与蛋白质发生交联稳定蛋白质，因此能较好的保存组织细胞的微细结构；虽然四氧化锇不和单独的核酸及糖类起反应，但当核酸糖类与蛋白质结合在一起时也能被固定，因此它几乎能和所有的细胞成分结合；四氧化锇电子密度高，能使被固定的组织产生良好的反差，本身起到染色的作用而其它对缓冲液的要求不高缺点缺点:1.它不能保护糖原不能固定核酸，对微管固定较差；2.四氧化锇渗透组织很慢，所以组织块要切的很小当组织块大于1mm以上时，不能得到完全固定3.四氧化锇不能保存酶的活性，因此不能用作细胞化学的固定剂•2.戊二醛和戊二醛固定液戊二醛和戊二醛固定液•戊二醛含有两个醛基，30％以上浓度的戊二醛易聚合，一般商品浓度在25％以下，含有较多杂质新处理过的戊二醛为无色或很淡的黄色，贮存久时颜色会变深由于戊二醛中的醛基易氧化为有机酸，使PH值下降当PH值下降到3.5以下时，就失去固定能力，需要纯化纯化的方法有蒸馏及用活性炭处理等方法•醛类固定剂固定后，一般需要四氧化锇进行二次固定，这就是广泛应用的双固定方法。

•戊二醛固定剂具有下列优点：1.它与蛋白质交联的能力是固定剂中最好的，也能固定糖原和核酸，对细胞内结构如微管等保存也较好，并能保存细胞内一些酶的活性，因此是保存精细结构最有效的醛；2.戊二醛的渗透速度比四氧化锇要快些，且反应快；3.戊二醛能够弥补四氧化锇固定剂的不足，对微管、内质网和细胞基质有较好的固定作用，可以避免四氧化锇做原始固定剂可能产生的抽提作用；戊二醛较适用于进行超微细细胞化学研究工作•戊二醛固定的主要缺点为：•1.它不能固定脂质，致使其在以后的脱水过程中被有机溶剂溶去，因而不适于作为单独的电镜固定剂； 2.戊二醛不像四氧化锇那样能提供高反差，因此与四氧化锇复合使用，则可发挥两种固定剂的长处，互相弥补不足之处； 3.戊二醛固定不影响细胞的渗透性，因此它对缓冲液及其渗透压要求较高•戊二醛通过交联作用稳定细胞的结构，对细胞膜系统、糖原、核蛋白和细胞基质的固定效果好固定时温度允许在4度至10度之间，固定的时间根据样品而定浓度一般用缓冲液配制成2-3%•3.多聚甲醛和多聚甲醛固定液多聚甲醛和多聚甲醛固定液•多聚甲醛：电镜样品固定多用纯化的多聚甲醛，为白色粉末多聚甲醛经水解后，解聚为甲醛溶液。

多聚甲醛的优点是能和蛋白质、脂类、核酸等起反应，并能保存部分细胞内酶的活性；多聚甲醛的分子很小，因此穿透组织的能力很强，对固定致密的组织以及较大的组织尤其合适此外，多聚甲醛价格便宜、使用方便但甲醛只有一个醛基，反应速度慢，与组织形成的交联数目比戊二醛固定液少，导致甲醛固定液的微细结构的保存和组织反差不如戊二醛固定液所以，多聚甲醛固定液一般多用于组织化学或快速固定在样品前处理中，一般用多聚甲醛固定液作为前固定，以后再用四氧化锇做后固定，能取长补短，效果好也可与戊二醛同时进行混合固定，效果更好 化学固定剂通常需用一定的缓冲液配制，缓冲介质在固定时所起的作用为：•使固定液维持稳定的PH，•使固定液有适当的渗透压，不使细胞收缩或肿胀；•提供适当的离子成分，使细胞成分不被抽提或成点•用于电镜固定液的缓冲介质有多种，如磷酸缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等由于大多数动物组织的PH值为7.4，因此缓冲液的PH值选择在7.4左右缓冲液及其配制•磷酸缓冲液 它的优点是便宜，无毒但缺点是久放易产生沉淀易遭到细菌的污染磷酸缓冲液的PH会随温度的变化而稍有变化，在PH7.5以下，它的缓冲能力很强，控制固定液的PH值比较有效。

磷酸缓冲液常用于配制戊二醛固定液•二甲砷酸盐缓冲液 此溶液配制比较简单，也比较稳定，能保存，不易被细菌污染；但有一定毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制尽量不使试剂与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入常用浓度为0.1mol/L•醋酸巴比妥缓冲液 醋酸巴比妥液在电镜技术的早期用来配制四氧化锇，固定效果比磷酸缓冲液的效果好此缓冲液缓冲能力较差，和醛产生作用后减弱缓冲能力，因此不能用来配制醛类固定液此外，该缓冲液易于被细菌污染，不能长期保存•4.影响固定效果的因素：影响固定效果的因素：•固定是一种复杂的化学过程固定液的PH、浓度、离子组成与渗透压、固定时的温度、时间与方式以及组织块的大小等因素都能影响固定的效果至今还没发现一种固定液适合任何一种组织，因此在实际工作中就需要根据不同的组织选用恰当的固定液和固定条件•固固定定液液的的PH 蛋白质是一种两性化合物，其相对分子质量以及其它理化性质与溶液的PH密切相关固定液的PH将影响细胞中原生质的组成、膜的选择性及酶的活性固定液的PH必须接近固定组织的PH，这样可以使细胞避免由固定液所造成的蛋白质结构和性质的变化•固固定定液液的的浓浓度度 一般来说，较低的浓度需要较长的固定时间，这样就容易引起酶的扩散、细胞物质的抽提及组织的肿胀。

过高的固定浓度液是不合适的，因为浓的溶液毁坏酶的活性和细胞的精细结构尤其是氧化固定剂，如锇酸和高锰酸钾，只有在适当的浓度下，才是有效的交联剂，较高的浓度就会造成蛋白质分子的断裂含水较多的组织，一般需要较高的固定浓度•固固定定液液渗渗透透压压及及离离子子组组成成 一般来说，低渗的固定液容易引起组织膨胀，而高渗的固定液容易造成组织的收缩为了调节固定液与组织的渗透压平衡，固定液中常加入钾、钠、钙盐等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质•固固定定的的温温度度和和时时间间 为了降低酶的活性、减少细胞自溶及胞内物质的抽提，大部分组织通常是在0-4摄氏度下固定1-4h，但细胞中的微管与微丝应在室温下固定由于化学固定所引起的物质的抽提是随时间逐渐进行的，因此，过度的固定可能丢失更多的物质•组组织织块块的的大大小小 固定作用通常是不均匀的，从组织块的表层到深部，存在着固定梯度表层有高浓度的锇的沉积，但这一层的机械损伤较大；中心部位无机械损伤但往往固定不足因此，在这两层之间的那一部分组织是比较理想的一般来说，锇酸的均匀固定大约在0.25mm的深度，因此组织块的大小最好在0.5mm3左右•固定是标本制备过程中及其关键的一步，也是复杂的化学过程。

其中的每个因素都会影响固定的效果5.3.3 漂洗与脱水 组织固定后，应用漂洗液洗去残留的固定液，尤其是醛类固定液固定后，一定要充分漂洗干净，一般需漂洗5次以上，漂洗时间为2h或过夜这是因为醛会和锇酸起反应，产生细而致密的颗粒沉淀在样品中，既影响锇酸的固定作用，又会造成样品污染此外，由于锇酸亦和乙醇作用，产生沉淀，因而用锇酸固定后，也应把多余的锇酸固定液漂洗掉，但洗的时间可以短些，10-15min即可常规电镜样品中所用的漂洗液一般是0.1mol/l磷酸缓冲液，其温度与固定液温度一致，为4度•大多数生物样品中水分的比例很高，达70-80%以上，而水中又有85-90%为游离态水，再加上包埋剂多为水不溶性物质，因此，如果包埋前不彻底除去样品中的游离态水将影响包埋块的质量单纯的烘干会使样品收缩变形，并破坏其超微空间结构，所以要进行脱水 脱水剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙二醇等，最常用的为乙醇一般用乙醇脱水时，其梯度浓度为30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%两次，每部10-15min另外，70%以前需要在4度操作，80%以后转至室温 如果选用环氧树脂包埋，用乙醇脱水后，最好再用环氧丙烷处理20-30分钟，以置换出样品中的乙醇。

因为乙醇与环氧树脂不能很好的混溶，可能会影响包埋块的质量• 脱水l脱水剂的梯度幅度和每步脱水的时间都有讲究，梯度过大，速度过快会使样品样品收收缩缩，而脱水剂的浓度在70%以前时，每步脱水的时间过过长长会会使使样样品品膨膨胀胀；在95%以后每步脱水的时间过长会使样品收缩；只有在70%时，因为与生物样品的渗透压相似，可停留较长时间l脱水过程中应注意两点：一是脱水要充分，脱水不完全会导致渗透不完全，造成切片困难，还会引起组织和细胞受损；二是更换脱水剂是动作要快，尤其是换无水乙醇时，不要使样品干燥，否则样品内易产生小气泡而影响包埋剂的浸透•组织块在脱完水后，要用一种常温下为液态、经过加温聚合后有一定硬度的介质对其进行处理，使处理后的组织有适当的硬度和良好的切割性能这种介质就称为包埋剂通过脱水剂稀释包埋剂，并最终以包埋剂完全取代脱水剂，使其渗透到组织块中的过程就是浸透而将浸透好的组织块放在适当磨具中并灌入包埋剂，再加温聚合成硬块的过程就是包埋5.3.4浸透与包埋•浸透的目的和方法：浸透的目的是用包埋剂逐步替代浸入样品内部的脱水剂，以填充样品超微结构的各个空间•包埋的目的： 经过脱水和浸透的样品还不能直接进行超薄切片，还需要用某种在一定条件下能聚合成硬块的单体树脂，来填充样品的各个空间，把这一过程称为包埋。

•聚合：有加温聚合、降温聚合、快速聚合、或慢速聚合、普通光照聚合或紫外光照聚合•理想的包埋剂应具备以下特征：理想的包埋剂应具备以下特征：•处于液态时粘度小、易渗透；•固化后既不膨胀也不收缩，并有一定的机械强度，有助于保存样品的超微结构和制备超薄切片并在电子束的轰击下性能稳定，不升华、变形和断裂，并且不干扰样品本身的而超微结构有良好的电子透过性•常用的包埋剂有环氧树脂包埋剂、聚酯树脂包埋剂和甲基丙烯酸脂包埋剂国内常用的为国产环氧树脂618、Epon812及低粘度Spurr环氧树脂•环氧树脂为热塑性树脂，是淡黄色或蜜黄色的液体分子中有两种化学反应基团，即环氧基和羟基末端环氧基易打开，与其它含有活性氢原子的化合物如胺类形成首尾相接的长链状聚合物•能够促进末端相接的交联剂叫做催催化化剂剂或或加加速速剂剂，它们能催化聚合反应，而本身并不加入到树脂链中•此外，单体中的羟基能和酸酐结合形成分子间的横桥连接这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬硬化化剂剂或或固固化化剂，它们参与交联反应并被吸收到树脂链中因此，环氧树脂单体、胺类、和酸酐三者按照一定的比例混合，在一定温度下可形成具有三维空间结构、稳定的抗热和抗溶的交联状聚合物。

浸透和包埋的具体操作•(一) 浸透•组织块在用乙醇和无水丙酮或环氧丙烷脱水后，用包埋剂与与环氧丙烷按照一定比例混合，逐渐渗透入组织块，取代乙醇因为包埋剂的黏度要比脱水剂大得多，所以要用环氧丙烷与包埋剂配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐渐增加，以提高样品的质量环氧丙烷和环氧树脂类的包埋剂较好的混溶，也有助于达到逐级浸透的目的浸透液的配置和使用方法如下：•环氧丙烷：包埋剂=3：1 （V/V） 30～60分钟•环氧丙烷：包埋剂=1：1 （V/V） 30～60分钟•环氧丙烷：包埋剂=1：3 （V/V） 30～60分钟•100%包埋剂 1-2h•注：在室温或是30-35度下浸透，必要时用慢摇床提高浸透的效果浸透的时间可以灵活的掌握•浸透完成后就要进行包埋操作：取要用空心胶囊或特制的锥形塑料囊或多孔橡胶模板作包埋块的模子包埋前先将胶囊或模板置于60度温箱中1-3h烘干；包埋时，先在胶囊中滴一滴包埋剂，再将组织块用牙签挑至胶囊中，然后注入包埋剂或先将胶囊注满包埋剂，再用牙签挑起组织块放在胶囊的液面中心，让组织块自然沉淀，然后进行聚合。

•使用不同的包埋剂，制备不同的样品，需要的聚合条件不同有加温聚合、降温聚合、快速聚合或慢速聚合、普通光照聚合或紫外光照聚合环氧树脂618、Epon812可置于37度烤箱中12h或过夜，60度36-48h，亦可直接放入60度温箱中聚合，时间为1-2d；Spurr树脂放在70度温箱8h即可总之，要使包埋剂完全聚合，才能有均匀的硬度否则会到导致切片困难5.3.5包埋及聚合硬化包埋操作中应注意以下几点：(1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；(2)所用器皿应烘干；(3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；(4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；(5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；(6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净 常用包埋模具常用包埋模具5.3.6修块与半薄切片定位•修块：是成功切出理想连续切片的关键通常采用手工修块，将已聚合的环氧树脂包埋块放入专用的样品夹中，在解剖镜下用单面刀片修去其顶端和组织周围多余的包埋介质，暴露出的表面积小于0.1mm2和低于0.2mm的小方台，修完后呈金字塔形•定位:由于超薄切片的面积极小，为了在电镜观察时容易找到所希望观察的部位，进行超薄切片前必须进行定位。

半薄切片定位利用超薄切片机切厚度为1μm-10μm的切片，称厚切片或半薄切片将切下的片子用镊子或吸管转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温，使切片展平，干燥后经甲苯 胺 蓝 染 色 ， 光 学 显 微 镜 观 察 定 位标本修块标本修块 半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去其余部分2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察半薄切片定位以后，要对包埋块作进一步的修整通常将块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm5.3.7超薄切片•包埋块修整好后就进入超薄切片阶段了要获得高质量的电镜照片，切片必须是超薄的，厚度均匀，表面平整，无震颤、无皱褶和破裂，且能耐受高真空和电子束的轰击•超薄切片机是用来将已包埋在环氧树脂中或已冷冻固定的生物样品制成纳米级厚度薄样品的专业机器超薄切片机从进刀原理构成上可以分为两大类：一类是以热膨胀为主的切片机，利用金属杆热胀或冷缩时产生的微小长度变化来提供推进一类是以机械推进式为主的切片机，用微动螺旋和微动杠杆微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进。

•70年代前生产的为热膨胀式，80年代开始向机械推进式过度，目前的超薄切片机大多数为机械推进式•1.热膨胀式超薄切片机 ：以LKB的系列产品为代表，该类超薄切片机的进刀控制由对热极为敏感的金属材料控制，当对其进行加热时，该金属规则膨胀，使切片机刀口缓缓向前推进，由于该种超薄切片机对温度极为敏感，所以在超薄切片的时候，对切片室的温度稳定性要求极高，温度变化大，易造成切片不稳定，切片厚度不易控制因此在切制50nm以下的生物样品及用钻石刀切片时，最好不用•2.机械推进式超薄切片机：以莱卡系列产品为代表，该类型超薄切片机的进刀以机机械械推推进进的方式进行由于采用了高精度的机械推进装置，使进刀的稳定性大大提高，摒弃了热膨胀式超薄切片机由于温度不稳定而带来的切片质量不易控制的缺点，如再配合使用钻石刀，则超薄切片的质量能够达到理想的程度•目前超薄切片机的类型基本上以机械推进式为主流Leica EM FC6 冷冻超薄切片机 •超薄切片使用的刀有两种，可选用钻石刀或玻璃刀钻石刀的质量好，不用特意制备，市售有多种型号供选择，经久耐用，切片时容易对刀和切出优良的连续切片，特别适宜质地硬的样品但其价格昂贵。

玻璃刀临用之前制作，刀刃易脆裂，通常一把刀切一个样品就得废弃，且适宜质地较软的样品，但价格相对便宜的得多这里讲的制刀指的是用制刀机制备玻璃刀的方法制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为5mm～6.5mm制刀制刀•玻璃刀用制刀机制作制好玻璃刀后，要围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上水槽有塑料水槽和胶布水槽两种塑料水槽有固定的形状，可反复使用胶布水槽是临时用胶布或专用塑料条制作的装好水槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水刀槽刀槽•刀刀的的检检查查和和保保护护：：明显的劣质刀是出现双刀跟（即无刀锋）、刀缘突起、刀缘凹陷或刀缘上有明显的裂损等，这样的刀不能用为了减少切片时的麻烦，有必要先检查刀缘是否有用肉眼不易看出的微小的损伤，及时淘汰劣质玻璃刀方法是把刀安放在切片机的刀架上，打开白炽灯，在显微镜下观察刀缘，如果刀缘成一条暗线（尤其是在刀缘的左侧1/3段内），说明其锋利无损如果刀缘上有许多反光的亮点，说明有小的裂损用这样的刀切片，k肯定有划痕，因此弃之不用为了保护刀缘，制刀和切片过程中绝对不能用任何异物去碰，并且最好现做现用，以免因放置过久，空气的氧化作用使刀缘失去锋利玻璃刀玻璃刀超薄切片的步骤包括：超薄切片的步骤包括：(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；(4)预切片；(5)换切片刀重新调节刀与组织块的距离；(6)调节切片厚度及切片速度，切片；(7)将切片捞在有支持膜的载网上。

•由于超薄切片切下的片子很薄，很难测量其厚度，因此，一般利用切片表面反射的光和从切片下面反射光所产生的干涉色来判断切片厚度，厚度不同的切片在显微镜下呈现的干涉色也不同用树脂包埋的切片，其干涉色与厚度的关系如下： 灰色：40-50nm；银白色：50-70nm；金黄色：70-90nm；紫色：90nm以上切片中可能出现的问题和解决的方法•产生问题的原因：切片的质量往往受到诸多因素的影响，切片中很可能会出现各种各样的问题，特别是有关切片质量的问题如：切片开裂、切片过厚（表面的干涉光五颜六色）、切片上有一行行的平行排列的条纹或纵行的划痕、切片不能连续成串等原因有以下几种，应具体分析：•A影响包埋块质量的因素-----包埋剂是否混合均匀，聚合的时间温度是否合适、样品渗透是否充分等•B 切片准备工作方面的因素----修快是否规范，刀口是否锋利，水槽的制作是否规范等•C 切片过程中的某些因素----刀角的选择，可能过大或过小，刀和样品的安装是否牢固和标准，切速过快过慢，对刀是否规范等•D 其它方面的因素---附近是否有大型机械振动源，电压是否稳定，室温是否过高或过低等•可能出现的问题和相应的措施：•A 切片上有颤纹：这是切片时最常出现的问题之一，其表现为切片上布满平行于刀缘的条纹，或粗或细，疏密不一。

这是在切片过程中有震颤引起的下表介绍了产生震颤的原因和解决的办法原因解决的办法 样品块太软把已修好的样品放在100度烤箱里再烤1-2h，重新包埋，适当加大硬化剂的比例如：MNA，改变聚合条件如：延长时间或提高温度样品块太硬重新包埋，适当加大软化剂比例如：DDSA，改变聚合条件如：缩短时间或降低温度等或改用钻石刀 修块面积太大重新修块， 切片面积小于0.1mm3为宜 样品固定不稳检查并旋紧样品臂上所有与固定样品有关的螺钮 刀固定不稳检查刀背是否紧贴刀架，检查并旋紧所有固定刀的螺钮 切片参数不适重新调整刀角和切速等 其它检查周围是否有大的震动源如：机械马达，人为碰撞切片机台面等 •B 切片破碎：切片破碎是不宜捞取的，不完整的片子在电镜观察时往往也得不到良好的图像其原因和解决的办法如下：•切片表面凹凸不平---用手动切片重新修块，直到切下完整的片子为止•包埋块脆---重新包埋，严格按照配方比例，并充分搅拌包埋剂和适当延长渗透时间另外，脱水不彻底也会使包埋块脆并有许多小空洞，有时甚至在修块时就能看到大大小小的空洞一般对于这样的包埋块就废弃了，并在重新包埋时注意严格脱水，在搅拌包埋剂时应尽量减少气泡的产生，并静置一段时间，使气泡排掉之后再用。

•C切片不能连成带：有的研究工作需要观察连续 切片，如果切下的片一个一个都散开就无法捞片，其原因可能如下：原因解决的办法对刀不良重新对刀，使样品头上下边缘和刀缘平行修块不标准重新修块，使样品头表面至少有两条对应相互平行，并使平面的边缘整齐笔直 刀钝换刀缘或换刀，使落片顺畅 水槽液面不平用注射器点滴或吸取，调整过低或过高的液面，使液面与刀缘持平 •D切片厚薄不匀：同一张切片有厚有薄的表现是切片的干涉色不一致，即有深有浅或五颜六色，这将直接影响成像的质量•切片上有空脂—---重新修块；立体镜下示透亮的区域为空脂，即指没有样品结构的区域空白包埋介质与有样品结构的区域的硬度是不一致的，因此用同一硬度的刀切片时，会导致切片的厚薄不均，解决的办法是在重新修块时去掉空白区•刀缘的锐度不一致----调整刀缘或换刀当刀缘的不同区域的锐度不一致时，刀缘锐利的部分切出的片子薄，反之则厚•E其它：•切片带水---指样品块头部和刀背上沾水，使无法正常切片解决的办法是用干净的滤纸条吸掉，但要注意操作时切勿碰刀缘，如果是水槽液面太高引起的，就需要重新调整一下液面•空切---切片时只有样品臂上下运动，却见不到有片下来的情况称为空切。

引起空切的原因可能是对刀不准，距样品太远或样品面与刀缘不平行也可能是加热不足或切速过快等•水面干涉色消失-----有时在切片过程中，本来已经调好的乳白的干涉色水面会缓缓消失，变成一片片黑影，使无法观察切片其原因是水槽的液面下降了，这可能使由于切片过程太长、水分挥发和连续捞片损失引起的；也可能使由于水槽漏水引起的5.3.8 电子染色•生物样品的化学成分主要是C、H、O、N等原子序数低的元素，再加上透射电镜要求样品先制成超薄切片（100nm左右），所以生物样品对电子的散射能力很小，图像反差很低为了提高生物样品的反差，首先要设法增加其对电子的散射能力选用重金属盐类进行电子染色可以达到这一目的•超薄切片的染色指的是用重金属盐溶液处理样品使其与细胞中某些特定成份结合或吸附在某些特定的结构上常用的重金属：锇、钨、铅、锰等因它们对生物样品中的不同组分有不同程度的结合力，因此样品中结合重金属盐的区域对电子的散射能力也会不同程度的增强，使电子图像显示深浅不一的黑白色这样既增强生物样品的反差，又增加了成像的层次，从而大大提高了电子显微图像质量 •铀盐：常用醋酸双氧铀配制电子染色剂醋酸双氧铀为荧光黄色粉末，再15度时饱和溶液的的浓度为7.7％，用50％或70％的乙醇配制可提高溶解度。

它能发射荧光，有微量放射性，所以应用时应格外小心染色时需避免强光照射，并且用棕色瓶子壁光保存•它的染色效应是通过双氧铀离子与样品中的生物分子基团结合而实现的生物分子基团能够提供一对电子，因而能于金属离子相结合，形成金属复合物一个双氧铀离子能与一个或多个生物分子基团相结合，形成不同的金属复合物而双氧铀离子与羧基和磷酸基的亲和性较强，对富含这样结构的物质有广泛而明显的染色效果，如：脱氧核糖核酸、蛋白质和结缔组织等•铅盐：常用柠檬酸铅（枸橼酸铅）配制电子染色剂•其染色原理：与样品中不同的活性基团的反应机制不同，但铅盐的染色效应是一种离子结合反应，即铅离子与活性基团的反应染液中的柠檬酸钠的作用是螯合溶液中的铅离子，并形成稳定的络合物这样既减少碳酸铅沉淀的形成，又能将铅离子带入样品在样品中铅与某些阴离子活性基团相结合，达到染色的目的细胞核与核蛋白颗粒对铅离子的亲和力强，而糖原较差•染色方法：常规超薄切片中常用的是醋酸铀—枸橼酸铅双染法•将1片洁净的牙科蜡片放在培养皿中，滴一滴过滤的醋酸铀染液到蜡片上，再将带有切片的载网覆盖在染液上，使有切片的一面与染液接触，染色时间30min，染好后用水将切片洗净洗干，再覆盖在用同样方法的在另一洁净蜡片上的铅染液上，有切片的那一面与染液接触。

铅染色时应严格控制染色时间5-7min即可，防止过染同时应尽量减少暴露爱空气中的时间，并可在培养皿的周围放些氢氧化钠结晶，以免铅染液与空气中的二氧化碳形成沉淀，污染切片超薄切片染色步骤超薄切片染色步骤超薄切片法流程•取材----按“快、小、轻、准、冷”的原则，在尽可能短 的时 间内将≤1mm3的样品放入 固定液•前固定----2 % -5%戊二醛，1小时 4℃冰箱保存•↓•清洗（1）----磷酸缓冲液 10-15分钟，3次•↓•后固定----1%锇酸1-2小时, 4℃冰箱保存•↓•清洗（2）----同清洗（1）•↓•脱水----酒精/丙酮梯度脱水：50%、70%、80%、90%，各10-15分钟/次，100%，10-15分钟/2次 •↓•浸透----包埋剂浸透3小时（可过夜）；•↓•包埋----用包埋剂将样品包埋在胶囊或包埋板里；•↓•聚合----置烤箱：37℃，24小时；45℃，24小时；•↓ 60℃，24小时；•超薄切片----用超薄切片机将样品切成厚约50nm•↓ 的超薄切片；•电子染色----醋酸铀30-40分钟，柠檬酸铅30分钟；•↓ 电镜观察透透射射电电镜镜样样品品制制备备程程序序5.4 冷冻超薄切片•冷冻超薄切片技术是在光学显微冷冻切片和电镜超薄切片的基础上发展起来的。

由于常规超薄切片技术中应用化学固定、有机溶剂脱水、树脂包埋等一系列处理，均可使生物样品受到物理和化学性损伤，引起组织和细胞内蛋白质分子变性，大部分可溶性成分及某些生物大分子物质被抽提或发生移位为了弥补这些缺陷，人们创造了冷冻超薄切片技术•70年代后，出现商品冷冻超薄切片装置，使该技术有了更大发展与普通的切片机相比，冷冻超薄切片的样品更富有真实性，它不会因为脱水而损失某些成分；也不会与包埋剂发生某种化学反应；更不会因为热聚合而使超微结构变形目前，此技术可在分子水平上研究新鲜生物样品的超微结构、各种生物大分子和某些元素在细胞内的分布状态，并在细胞化学、免疫电镜、X射线微区分析及可溶性物质放射自显影研究等方面发挥巨大作用 •它的特点是用新鲜的材料直接冷冻固定，无需进行脱水、渗透、包埋与聚合等一系列繁琐的程序但要在冷冻之前进行预固定和冷冻保护处理，然后用冷冻超薄切片机进行切片冷冻超薄技术的难点是在样品制备过程中容易造成冷冻损伤和干燥损伤等，大大降低样品的价值因此，人们先后研究了多种冷冻保护剂，如：甘油、二甲基亚砜、高浓度的蔗糖等 •一般冷冻超薄切片样品的制备包括取材、冷冻保护、冷冻固定、冷冻超薄切片、冷冻干燥、染色等。

 冰晶损伤是冷冻样品制备技术最容易产生的缺陷它是由样品中的游离态水分冻结而造成的一种样品结构的损伤，主要是由于冷冻速率不足引起的一方面，冷冻速率不足时，细胞外的介质先结冰，形成冰晶（晶核），并以此为中心再吸收周围的水分，使冰晶逐渐增多这种吸收作用使细胞内游离态的水逸出，造成细胞受损，最终导致结构断裂变形另一方面，当冷冻速率比前者高些，但仍不足够高，虽然细胞外介质中的水分与细胞内的游离态的水都结冰了，细胞内的游离水不会逸出，但由于冷冻速度不足而形成了冰晶，从而导致细胞的精细结构断裂变形一般冷冻速率不足的主要原因是冷冻的温度过高当温度在-140度～-70度时，水结晶的形状为立方形或六角形结晶，当样品中存在结晶状的冰时，必然导致样品本身精细结构的损伤，冰晶损伤就是这样形成的解决的办法是选择优质冷冻剂和使用高效冷冻装置冷冻保护的意义冷冻保护的意义：： 另一个原因是样品过大，使深层区的细胞冷冻速率变慢，因而易遭受冰晶损伤解决的办法是尽量减小样品的体积最佳的冷冻效果是冷冷冻冻速速率率足足够够大大（（大大于于1000度度/秒秒）），，冷冷冻冻温温度度足足够够低低（（-160度度以以下下）），，使使细细胞胞中中游游离离态态水水迅迅速速形形成成无无定定形形水水，，而而细细胞胞中中与与蛋蛋白白质质或或脂脂肪肪结结合合的的结结合合态态的的水水却却不不结结冰冰。

这样的冷冻效果既可以保存样品中超微结构，又可以保存样品中的许多生物大分子和酶的活性，因而，对细胞化学、免疫电镜、放射自显影和X射线微区分析等方面的研究都非常有利除了用优质冷冻剂和减小样品体积之外，防止冰晶损伤的一个有效的方法是在冷冻之前对样品进行冷冻保护 用生物样品做冷冻超薄切片的取材原则是快、准、小，样品越新鲜越好但生物样品含水量高，如果不经冷冻保护，即使样品块已足够小，在冷冻固定和冷冻超薄切片的过程中仍易形成冰晶而破坏样品的超微结构有多种保护剂，如：甘油溶液、二甲基亚砜溶液、高浓度蔗糖溶液等，根据样品的情况选择冷冻保护剂一般组织的含水量越高，所需冷冻保护剂的浓度也越高，因为这样能保证冷冻固定时达到“玻璃化”而不产生冰晶以达到冷冻保护的目的为前提，用冷冻保护剂处理的时间可依样品的要求而定，一般从10min到几个小时不等其实，冷冻保护的原理是，用高浓度的冷冻保护剂处理生物样品之后，样品中所含的游离态的水与冷冻剂结合，使样品中液体的浓度提高，与此同时就降低了样品的冷冻点，这与盐水不易冻结的道理是一样的，其结果是防止样品中形成冰晶取材与冷冻保护•有时还可以在冷冻保护之前先对样品进行预固定，以提高样品结构的稳定性。

常用醛类做预固定剂根据研究的目的和材料来选择预固定剂和固定的条件一般研究超微形态学可以选用2.5％的戊二醛溶液，4摄氏度下固定15～60分钟 •直接冷冻固定含水分高的新鲜生物样品时，即使选择最佳固定条件，也难使样品完全达到玻璃化而无冰晶损伤一般固定效果理想的区域只是从样品表面算起约10微米以内深度的那部分因此，为了提高冷冻固定的质量，可先选用金属镜冷冻固定法，使样品的内表面平整，再于低温条件下，用预冷的修块刀将样品平面整修出一个小平面，面积约有0.2mm，然后再进一步冷冻固定如果样品需要预固定，则可以在预固定的过程中，用锋利的刀片将样品的头部切成方形或梯形，冷冻固定时注意把修好的那面调节到切片的位置上，使切片平整且大小适宜快速冷冻固定•冷冻超薄切片质量的好坏直接决定于快速冷冻效果常用的快速冷冻方式有二：•一是液氮直接冷冻；•二是金属接触冷冻后一种方法较好，即将铜块先置于液氮中，待温度平衡后，将样品与铜块接触5～10秒钟，以达到快速传导降温的目的，然后再将样品置于液氮中待用•有很多冷冻固定装置，目前常用的有KF80冷冻固定装置、KF80.MM80金属镜冷冻固定装置和MM80E金属镜冷冻固定装置。

•冷冻样品的保存：当冷冻固定的样品一时用不完时，可以保存一段时间，保存方法有以下几种：•将样品放在冷冻超薄切片机的样品托上，一同进入液氮罐•将样品放入一个微孔小金属笼中，扣紧盖，浸入液氮罐中笼子上系上金属丝，标上样品名称，并用盖压住金属丝，需要样品时提出来即可•将样品暂存在缓冲液或醛类固定剂中•用这些方法可以保存样品若干星期或几个月 冷冻超薄切片•　(1)冷冻超薄切片机：该机是在固有型超薄切片机基础上附加低温操作装置组成的•常用的机型是配以LKBCryoKit冷冻装置的瑞典LKBⅢ型(或Ⅴ型)超薄切片机该装置包括：冷冻室、冷冻刀台、冷冻样品头、存放液氮的杜瓦瓶及温度和液氮水平控制器等•冷冻室是一个具有绝缘性能的塑料箱它将冷冻刀台和冷冻样品头罩在其内刀台、样品头分别有管道与杜瓦瓶相通，并通过管道不断向它们输送液氮；在刀台和样品头内有温度传感器及加热装置，有盛放致冷剂的容器，容器内还有致冷剂水平感受器当用液氮作致冷剂时，其样品头温度可控制在-70℃～-170℃，刀温控制在-70℃～-150℃温度传感器是由温度及液氮水平控制装置进行自动调节,其调节过程是向刀台和样品台的致冷剂容器中灌满液氮。

若将控制装置的温度选择在-100℃的位置，刀台和样品头的温度下降到-100℃以下，则传感器即给控制装置发出温度下降的信息，控制装置即可通过加热器产生补偿的加热电流，使刀台与样品头的温度保持在-100℃的状态在切片过程中，由于液氮的不断消耗，致使容器中的致冷剂不断减少而液面下降，容器中的白金电阻器可感受液氮量的变化当液面低于预定标准时，白金电阻器即可引起杜瓦瓶中的加热器工作以提高瓶中的压力，使瓶中的液氮向致冷剂容器中流动，直至容器中的液面又恢复到原来的水平为止 冷冻超薄切片的主要操作步骤•完成冷冻固定后，就能把样品装入冷冻超薄切片机进行切片了当然在转运样品的过程中要使其始终浸没在液氮中另外，还要事先打开冷冻超薄切片机，预冷到所需的温度冷冻超薄切片机主要有以下操作步骤1.选择切片的时样品的温度选择切片的时样品的温度 因为温度与生物样品的超微结构有密切的关系，如：生物样品在低于-35摄氏度时，形成冰晶的速度可减慢到忽略不记的程度而细胞内的小分子物质和元素能稳定在原位的温度的温度条件是-80摄氏度以下另外在-140度以下时样品中的无定形固化水分（玻璃态冰）才不会发生不可逆的变形等。

所以样品冷冻固定后为保证切片的质量在整个切片的过程中仍必须保持一定的低温条件当然在选择切片过程中样品的温度时，还要考虑到研究的目的•选选择择切切片片时时刀刀的的温温度度：一般刀的温度要比样品的温度高处10-20度为宜理论上认为这样利于切片，否则切下的片子粘在刀上不易沾取选择好所需的温度之后，冷冻切片机可自动调控到位，并在这个切片过程中维持所设温度但如果操作不当，会引起样品和刀的温度过多的波动，严重时还会影响切片的质量，使切片厚薄不均匀等避免的办法是严格按照程序操作，以及切片时所用工具都要在液氮中预冷•选选择择切切片片的的厚厚度度和和速速度度：：切片时刀与样品之间相互摩擦会产热，如果切速过快，产热将增加，到一定程度就会损伤切片，因此控制切片的速度是必要的一般选择切速小于0.5mm/s为宜，如果切速大于1mm/s，就不易获得质量理想的切片尤其对于那些用新鲜材料冷冻固定的无定形玻璃化样品，更要小心切片的厚度可根据研究的目的选择，一般70-100nm之间比较适宜，太薄的冷冻 切片不易完整保存•刀的选择刀的选择：冷冻超薄切片和普通超薄切片一样，可随意选择玻璃刀和钻石刀但要注意以下几点：•第一，要在切片之前冷却刀；•第二，由于钻石刀和金属槽架的质地不同，热胀冷缩的系数就有差异，经反复使用之后，两者之间就有可能会产生裂隙，使刀缘晃动，而影响切片的质量；•第三，有人主张在玻璃刀上喷上薄薄的一层钨，使刀口更锋利耐用；•第四 ，如果切片时注入水槽的液体有腐蚀性，用钻石刀切片完成之后，一定要彻底清洗干净，并再最终用100%乙醇点滴冲洗一下刀口，然后自然晾干，以免使钻石刀的金属槽架受到腐蚀，导致刀口松动；•第五，在制作玻璃刀的水槽时，最好用导热快的铝箔胶条，并用耐冷的硅胶封边。

•切片的收集切片的收集：冷冻超薄切片的收集比普通超薄切片要复杂一些，操作技巧更需熟练，才能顺利完成切片的醛过程一般，收集切片的方法有以下几种•液滴沾取法液滴沾取法：这种方法比较简单可靠，可以直接用干刀切片，不需制作水槽 •漂浮捞取法漂浮捞取法:用这种方法收集切片需要制作刀槽和选择槽液显然，冷冻超薄切片需选用在零下及湿度的低温下仍不会冻结的溶液，如：乙二醇、二甲基亚砜、甘油、液氮、氟利昂等可以根据研究的目的和样品的条件进行选择有两种漂浮捞取法，一种是直接用预冷的已覆盖支持膜的铜网沾取；一种是用直径2mm的所料环圈住漂浮的切片，先迅速转移到水面上以洗掉多余的槽液，在轻轻转移到有支持膜的铜网上，而铜网是平放在滤纸上的，以吸收多余的水分，并使切片自然展平切片操作 ①向刀台和样品头的致冷剂容器中倒入液氮，使冷室的温度达到稳定的低温状态； ②安装冷冻的样品头、玻璃刀(或钻石刀)，调整刀与样品的距离，调好温度及液氮水平控制装置； ③自动切片，冷冻超薄切片的具体方法有以下两种：一是湿刀法，即用液槽法切片槽里的液体需在低温下不冻结的液体，如二甲基亚砜、甘油、乙烯乙二醇、异戊烷等当用二甲基亚砜时，其6％的水溶液在-60℃时可不结冻。

切片时样品的温度常为-60℃～-80℃，刀温高于样品温度10～20℃为宜其操作与常规超薄切片法相同，但宜放慢切片速度；二是干刀法，即不用液槽法，而用滴管上的饱和蔗糖液滴，粘起玻璃刀上的切片，然后将凝固的蔗糖液滴从冷冻室里移出，在室温下待蔗糖融化后，利用其表面张力使切片展平，并放在附有支持膜的载网上，用双蒸馏水洗去蔗糖后染色但亦有人用注射器吸取30％甘油或二甲基亚砜液滴的方法，同样获得满意效果 染色•用载网捞取切片后，就该进行电子染色了染色的方法很多，要根据研究的目的进行选择如：一般研究超微结构，可选负染法；做免疫电镜，需要进行免疫标记另外还有正染法和其它染色方法•正染：可进行常规的铀染和铅染但操作时要格外小心，因为冷冻切片没有包埋介质支撑和加固，所以在清洗时极易破碎和脱落•负染：是通过染样品结构的背景，来反衬显示样品本身的结构的一种电子染色的方法，所以被称为负染它的特点是简便，能较好地保存样品的结构，分辨率高常用于一般形态学观察目前常用的负染剂有磷钨酸、醋酸铀、钼酸铵、硅钨酸、硼酸钨纳等一般用蒸馏水或缓冲液配制，常用浓度为1%~2%，也可根据需要配制成0.2%-5%不等必要时可以用氢氧化钠或盐酸来调节染液的pH。

负染的时间一般都不长，由几秒至一分钟左右即可微波技术在电镜样品制备中的应用•微波是一种频率为2500MHz的电磁波当它辐照在样品上时，组织内的极性分子，如水、蛋白质的进行链等就暴露在一个快速变化的电磁场中这些极性分子随着电磁场极性的变化，不断发生180度的振动，振动频率达2.5*109次/秒微波的穿透力很强，可以穿透生物组织达几个厘米在组织内部，快速的分子振动可以产生大量的热能并且加速分子的能量和碰撞概率，增加化学反应的速度•在电镜样品的制备过程中，微波的上述特性，使微波在固定、脱水、浸透、染色和聚合等多数环节中得到广泛的应用微波的热效应和加快化学反应速度的效应可以使组织细胞得到良好的固定；可以加快脱水浸透和聚合的速度，大大缩短制样的时间因此，微波作为一种安全、清洁、快速的样品制备的辅助手段，在电镜样品的制备过程中，特别是在临床病理的快速诊断工作方面得到极大的实用价值•微波炉的功率为800w，设有六档，常用的为MEDHI和HI两档电镜样品制备个程序中微波的应用•一取材:取新鲜组织，并将其切成0.6-0.8mm3大小的组织块•二固定：将组织块放入盛有固定液的青霉素小瓶中取一直径为200mm的培养皿，盛水150ml。

在每次用微波固定时，将青霉素小瓶放在此培养皿中前固定：4％多具甲醛，HI档20s，2次，间隔20min漂洗：0.1mol/l磷酸盐缓冲液（PH7.3），MED档20s，5次，间隔5min后固定：1％锇酸， HI档20s，2次，间隔20min•三、脱水：将经过固定的组织块用0.1mol/l磷酸盐缓冲液漂洗2次，每次3min，再一次用50％ 、70％、 90％ 乙醇，90％ 丙酮MED档20s间隔2min纯丙酮MED档20s，三次，间隔5min•四、浸透：镜组织块置于纯丙酮与包埋剂按照1：1混合的浸透液中，MED档10s，2次，间隔10min；然后再将组织块置于纯丙酮与包埋剂按照1：2混合的浸透液中，MED档10s，3次，间隔10min；最后用纯包埋剂浸透组织块，MED档10s，2次，间隔10min•五包埋：常规包埋、聚合•六切片、染色：切片同超薄切片法、染色：醋酸铀MED档10s，室温放置10min；硝酸铅MED档10s，室温放置5min微波使用注意事项•微波与化学固定剂的混合固定方法使细胞超微结构保存良好，目前已被广泛使用微波固定的关键是温度的控制问题，在使用微波照射时，温度要控制在37摄氏度以下。

有些样品在进行微波辐照时要特别注意如：肺、软骨等，这些组织中的水或气体在进行微波照射时会发生爆炸现象因此对这些组织进行微波照射时应采用低功率、短时间多次的方法，一般用低档功率，每次辐照5s以下，重复4-5次，每次间隔10s左右在采用微波辐照时，要根据微波炉的特点、不同的季节温度变化以及组织特性等探索调整出最佳试验条件应用举例一、贴壁细胞的电镜样品制备-----原位包埋法原位包埋法常用于包埋人工培养的贴壁细胞，为了不改变细胞之间本来的排布位置，就在培养皿内进行包埋的一系列操作步骤这一方法常用于研究细胞之间的连接装置，以及细胞骨架和分裂期细胞的超微结构等方法如下：1.前固定：在直径3cm的塑料培养皿内培养细胞，贴壁生长到一定密度之后（一般3-4天），用吸管吸培养液，紧接着加入缓冲液冲洗1-2次，每次5-10分钟，再加入3%的戊二醛/缓冲液进行前固定，室温下1-2h2.后固定：吸出戊二醛固定液，加入缓冲液洗一次，5分钟后吸出，在加入预冷的0.8-1%的锇酸/缓冲液进行前固定，4摄氏度下固定15-60分钟3.脱水：系列乙醇脱水，每次10分钟（注意：用吸管将每次的废液吸干净，并立即注入下一级的脱水剂，以防细胞干燥引起变形。

只有在70%的乙醇中可以停留较长时间，脱水到80%以后可以从4摄氏度转到室温下进行100%乙醇脱两次）•4、浸透、包埋、聚合：浸透的方法、包埋剂的配方和聚合的和时间参考前面，所不同的是这里的这几步操作都要在培养皿中进行注意包埋时，向培养皿中注入的包埋剂约2mm深较合适，过深或过浅都不利于下面的操作•5、修块：把聚合好的样品从培养皿底部剥离，在光镜下找到细胞密集的部位，并用双面刀片划痕做记号再用钢丝锯将包埋片沿划痕据称4mm2的小块•6、粘块：用万能胶将锯好的包埋块粘在事先准备好的空包埋块上（注意有细胞的一面朝上），静置一天，待粘牢后再进一步按照常规包埋块处理因为单层培养的细胞有时生长分散，最好先做半薄切片，标出细胞密集区后再进一步修块二、悬浮细胞电镜样品制备•将细胞连同培养液放在尖头离心管中离心5min，2000r/min，后弃上清夜，加入4％多聚甲醛（用PH7.3，0.1mol/l磷酸缓冲液配制），并用滴管轻轻吹打，使细胞悬浮于固定液中，并在4摄氏度下固定4h然后用0.1mol/l磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min再沿管壁轻轻滴入2.5％的戊二醛2-3ml微波中固定5-10s后，置4摄氏度，1h，用带钩针的解剖针勾出细胞团块，切成1mm3大小的组织块，其余步骤同常规电镜制样进行。

三、细菌电镜样品制备•悬浮液中细菌制备基本同悬浮液细胞制样法菌丝可用洁净小刀在生长良好的菌丝体琼脂部位取数小块，立即投入4％戊二醛或多聚甲醛染液中固定4-6h对一些细胞壁很厚的细菌，在固定前可先用1.5％高锰酸钾水溶液处理2h，或固定液中加入2％鞣酸进行固定充分漂洗后再用1％锇酸固定2h，然后酒精逐级脱水一般来说细菌标本的脱水及浸透时间要适当延长或经微波照射处理•低温包埋法•低温包埋剂的特点是聚合时不用加温，依据包埋剂种类的不同可以在室温下，或在-20摄氏度以下聚合，这一特性对研究生物样品的化学成分、抗原或抗体的分布、急速的动态示踪、以及某些元素的分析等都是有利的尤其在没有冷冻超薄切片的设备时，应优先考虑使用低温包埋剂，以防止聚合加温时引起某些化学反应，或某些抗原和抗体的灭活以及某些元素的位移等不良后果第六章第六章 扫描电子显微镜的扫描电子显微镜的样品制备技术样品制备技术6.1 SEM样品制备的基本要求 SEM对样品基本要求：•基本性质：干净干净、干燥、导电干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱•大 小：直径最大不宜超过10 mm，高度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下，样品尽量小为宜。

•对试样的要求试样可以是块块状状或粉粉末末颗颗粒粒，试样大小要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大样品座尺寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ，大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右•表面受到污染的试样，要在不不破破坏坏试试样样表表面面结结构构的的前前提提下进行适当清洗，然后干燥•新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态有些试样的表面、断口需要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干•要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥除去水分•对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场的影响•要求导电，不导电的观察前进行导电处理•块块状状试试样样扫描电镜的试样制备是比较简便的对于块块状状导导电电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察对于块块状状的的非非导导电电或或导导电电性性较较差差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜以避免电荷积累，影响图象质量。

并可防止试样的热损伤6.1.2块状试样的制备6.1.3粉体试样的制备•粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上，用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒•对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时，将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散，再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上，待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可粘附在样品座上•在制备在制备SEM样品时，必须掌握以下原则：样品时，必须掌握以下原则：•(1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；•(2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止镜筒的污染但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避免样品体积变小和收缩变形等人工假象；　　•(3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的充放电效应；　•(4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护样品的观察面 6.1.4常规生物样品制备技术常规生物样品制备技术•制备过程如下：•①取材 根据需要，切取适当大小的样品专门的SEM备有灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。

装在透射电镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左右•②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态，但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构，使其不致因不慎的操作造成人为损伤•③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟，较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间•④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛•⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min有时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合使用•⑥漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸•⑦脱水 用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％丙酮或乙醇溶液各10-15分钟，大于1mm的样品可脱水10～20分钟•⑧干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自然干燥或45℃热风吹干有些研究工作要求尽量完好保存样品表面的精细结构，可用真空干燥法、冷冻干燥法和临界点干燥法等使样品干燥这些方法都比空气干燥法效果好，其中临界点干燥法优点多，多被研究工作者采用•⑨导电 ：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理6.2.1固定与脱水•样品的固定：为了把生物样品的微细结构和外部形态真实的保留下来，SEM样品必须进行固定处理。

通过固定还可以使组织硬化，从而增强样品在干燥过程中耐受表面张力变化发生龟裂，还能提高样品耐受电子束轰击的能力常用的固定剂为醛类和四氧化锇，还有多聚甲醛和高锰酸钾等固定的方式有浸泡固定、灌注固定、微波和化学混合固定•脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用采用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分6.2.2 样品的干燥：•1. 自自然然干干燥燥法法：：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表面比较坚硬或含水分较少的生物样品如：昆虫、骨骼、牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如细菌等具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100％，在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥因为脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多变形而影响其结构•2. 真真空空干干燥燥法法：是直接将固定及脱水的样品放入真空镀膜仪内，在低真空状态下使样品内的溶液逐步挥发，当达到高真空时样品即可干燥，随后进行金属镀膜这一方法简单易行，但是仍存在一定的表面张力问题，固在缺少其它的干燥手段时才选用•3 临临界界点点干干燥燥：目前最理想的简单的干燥法。

临界点干燥仪利用物质在临界状态下液体表面张力逐渐被消除的特性，减少样品干燥过程中的变形和收缩，从而达到样品的完全干燥•4 冷冷冻冻干干燥燥：在此过程中，样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响但这种方法的不足之处是样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构6.2.3 临界点干燥 临临界界点点：：在一一定定的的温温度度和和压压力力下，某物质的液液态态和和气气态态界界面面消消失失，由液态瞬瞬间间转化为气态，此时的温度即该物质的临界点温度（C.T），同时也是该物质的临界点（C.P）而此时的压力和该物质的密度称为临界压力和临界密度不同的物质有各自的临界点和临界压力在在临临界界点点时时表表面面张张力力作作用用消消失失，，分分子子之之间间的的内内聚聚力力等等于于零零临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质 干干燥燥剂剂：：考虑到生物样品有限的承受力，一般选择低温和低压临界点的干燥剂.有多种物质可以作为临界点干燥的干燥剂，如：液态二氧化碳、干冰（固体二氧化碳）、氟利昂以及一氧化二氮最常用的为液态二氧化碳常用几种干燥剂的临界值干燥剂临界温度/摄氏度一氧化二氮氟利昂13氟利昂23液态二氧化碳、26.528.925.931.1临界压力（kg/cm2）标准大气压下71.238.247.772.8临界点干燥法原理临界点干燥法原理•在干燥过程中，表面张力会使样品变形。

因此，为了保持样品的完好形态，必须消除表面张力造成的影响我们知道，液体表面张力随其温度的升高而急骤变小对于每一种液体，都有一个表表面面张张力力为为零零的的温温度度，，这这个个温温度度叫叫临临界界温温度度与临界温度对应的压力叫临界压力，在临界温度和临界压力下使样品干燥的方法叫临界点干燥法现在，国内外都有商品临界点干燥仪•照理，含水样品可以直接进行临界点干燥可是，由于水的临临界界温温度度高高达达374℃℃，，临临界界压压力力高高达达2.47×10６６Pa(218个个大大气气压压)，，这样高的温度和压力不仅会破坏样品的形态构造，而且需要耐压很高的仪器解决这个问题的办法就是选择临界温度接近室温，临界压力接近大气压的液体取代样品中的水，然后对这种液体进行临界点干燥，使样品达到干燥的目的这种液体叫做转转移移液液对转移液的要求，除要求其适当的临界温度和临界压力外，还应考虑其毒性、密度、成本和溶剂性质等，一般常用液体CO2液态CO2临界点干燥法的过程临界点干燥法的过程•样品固定后系列乙醇脱水到100％•中中间间液液替替换换：因为样品要从脱水剂乙醇经中间液过渡到转移液因此，中间液既要和脱水剂互溶，又要和转移液互溶。

具体步骤是：脱水后的样品在70％乙醇与30％醋酸异戊酯混合液中浸10～20分钟，然后再在30％乙醇与70％醋酸异戊酯混合液中浸10～20分钟，而后用100％中间液(醋酸异戊酯)浸两次，每次各10～20分钟•转转移移液液替替换换：用CO2作转移液替换中间液的过程，是在封闭的耐压室内进行的用酒精或丙酮清洗临界点干燥器的进气管道和耐压室，吹干后，反复1～2次放入和排出液体CO2，然后在耐压室底部放数层滤纸，并将装有样品的样品架放入拧紧耐压室盖，慢慢放入液体CO2然后稍开排气阀，以5L/min的流量排出耐压室原来的气体，此时可闻到醋酸异戊酯味，待醋酸异戊酯味消失后，关闭排气阀•此时通过观察窗观察室内液体CO2应浸没样品(如果不能浸没样品，说明耐压室温度高，应降温后再行操作)，关闭进气阀，停放约1～2小时以完成CO2的置换过程此时压力约为5.6×1０6～6.4×１０6Pa(57～65Kgf/cm2) •加加热热：：用60℃温水或自动调温装置将耐压室加温，压力很快增加，使压力维持在1.11×１０7Pa(110Kgf/cm2)左右5～10分钟，CO2全部汽化，从观察窗可看到其汽化过程是：液面上升→界面模糊→完全混浊→透亮无液体。

这时的压力约为9.3×１０6Pa (95Kgf/cm2)•排排气气：：在排气管口放一温水杯，这样既可观察排出的气泡数以控制排气速度，又可避免排气管路产生干冰而造成堵塞慢慢打开排气阀，使压力缓慢下降，并维持耐压室温度在50℃左右排气速度不可太快，否则会损伤样品，一般控制在10泡/秒左右［约每分钟4×１０5Pa～9.8×１０ 5Pa(5～10Kgf/cm2)的降压速度］大约经一个多小时的排气后，压力表指示为“零”，排气口无气泡时，即可打开耐压室，取出已干燥好的样品 临界点干燥仪临界点干燥的失误和解决办法•1.样品干燥不充分：这是最常见的问题，可能有以下几种原因：•（1）脱水不彻底，中间液醋酸异戊酯和液态二氧化碳置换不良，最终导致干燥不充分•（2）醋酸异戊酯反流：在冬季反复使用仪器，可能使醋酸异戊酯凝结在排气管上如果此时打开样品室盖，由于气压的变化，会使排气管中的醋酸异戊酯反流，并浸湿已干燥好的样品解决的办法是沿样品室的内壁垫上一层滤纸，用来吸附反流的醋酸异戊酯•（3）一次干燥的样品过多：样品笼的高度一般以不超过样品室深度的一般为宜否则样品过多，带入的醋酸异戊酯也过多样品不易干燥充分2.样品室内压力达不到要求：•（1）注入液态二氧化碳量过少：可能会使样品位于二氧化碳的气液面交界处，样品受到液体二氧化碳表面张力的作用，尽管比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精细结构。

•（2）样品室密闭不良：这可能是因为垫圈老化，有裂纹，或垫圈下有异物等3.注入液体二氧化碳困难：主要因为样品室的温度高，没有事先降温夏季室温高于30度时更易造成注入困难降温的办法有两种：一是用少许液体二氧化碳充盈2-3次，再放掉气体的二氧化碳；二是用控温钮调制低于室温10度6.2.4 冷冻干燥法•在冷冻干燥过程中，样品中的水分直接由冰态升华为气态，样品也不受表面张力的影响但这种方法也有不足之处，如：样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构因此需要大量的冷冻剂和较好的真空装置，使造价提高再加上所需冷冻时间过长，更限制了这种方法的使用所以，尽管用这种方法能较好地保存样品中的水溶性和脂溶性 物质，但是使用仍不普遍有下面两种方法： 一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品把样品粘附在小铜片上后快速投入丙烷中进行冷冻固定，丙烷须用液氮预冷固定好的样品放入真空喷镀仪中，用液氮冷却，保持一定的温度压力连续抽真空若干天，直至样品完全干燥为止•乙醇冷冻干燥法：乙醇冷冻干燥法： 按照常规方法戊二醛固定，乙醇梯度脱水至100%把样品投入注满液氮的冷冻干燥仪的金属杯中使样品中的乙醇固化。

把金属杯放入冷冻干燥仪的喷度装置中，通过旋转泵抽气使液氮固化并升华，接着固化的乙醇也升华，样品随之干燥6.3 导电•大多数生物样品的表面电阻很高，直接用扫描电镜观察会产生充放电效应，所以要对样品进行导电处理常用的导电处理方法有金属喷镀法和导电染色法金属喷镀法和导电染色法•金金属属喷喷镀镀法法是将干燥后的样品用导电胶粘在样品台上，放入真空喷镀仪内或离子溅射仪内喷约15nm厚的碳或金，随后进行电镜观察这种方法除可消除充放电效应外，还可提高二次电子发射率缺点是热辐射和原子轰击会使样品变形•导导电电染染色色法法是用金属盐类化合物与生物体的蛋白质、脂类、糖类等结合，使表面离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子间，从而使样品表面电阻值降低，消除充电放电效应，同时在一定程度上起硬化组织的固定作用6.3.1 金属镀膜法•金属镀膜法就是把样品镀上一层很薄的并且非常均匀的金属膜（一般20nm厚的金膜）因为金的化学性质比较稳定，不与样品中的化学成分反应，使既不影响样品本身的结构，样品又有导电性经过金属镀膜的样品，能产生大量的二次电子从而提高图像的而质量另外还能加强样品对电子束轰击的抗击力，以减小电子束对样品的损伤。

•有两种方法，一是离子溅射法，二是真空喷度法在电场的作用下，使真空罩内残留的气体分子被电离为阳离子和电子，它们分别飞向阴极和阳极并不断的与其它的气体分子相碰撞，表现为紫色的放电现象此外，阳离子又可以轰击阴极上的金属靶，使部分金属原子被激发出来，这些金属原子在电场的加速作用下，可从不同的方向和角度飞向阳极呈漫散射的方式覆盖在样品的表面，形成连续而均匀的金属膜薄膜的厚度可以控制在1-100nm之间，这样既不掩盖样品的表面结构，又使样品具有了良好的导电性6.3.1.1离子溅射法原理离子溅射法原理离子溅射仪1.因为飞散出来的金属颗粒为原子或分子很小，所以镀膜质地精细2. 因为金属颗粒带负电，样品表面带正电，且各部位的正电位相同，使金属颗粒均匀的飞向带正电的样品表面，所以镀膜均匀3. 镀膜仪通过调节电流强度和真空度来控制飞散出来的金属颗粒的数量，从而有效的控制镀膜的厚度，使其既不遮盖样品表面的微细结构，又能具有良好的导电性4. 离子溅射时原子的能量大约为真空镀膜时原子能量的100倍，所以溅射镀膜的附着力强离子溅射镀膜的特点离子溅射镀膜的特点6.3.1.2真空镀膜的原理及特点•在真空的条件下，把金属丝加热到一定的温度时，该金属就会急剧地蒸发。

此时，如果把样品放在距金属丝5cm左右处，蒸发的金属原子就会洒落在其表面，使其覆盖上一层金属膜，真空镀膜仪就是根据这一原理设计的•由于镀膜是在真空条件下进行的，因此即可以防止样品受传导和对流引起的热损伤，又可以防止样品受金属氧化引起的污染•并且在镀膜的时候样品台旋转使样品表面的镀膜均匀•一般用铝和铜，比离子溅射法成本低•对于样品表面凹凸明显的，最好先喷一层碳以加固其表面结构，而离子溅射法不能喷碳，所以对于这类有特殊要求的样品选用真空镀膜仪•离子溅射镀膜与真空镀膜相比，其主要优点是：•（ 1 ）装置结构简单，使用方便，溅射一次只需几分钟，而真空镀膜则要半个小时以上 2 ）消耗贵金属少，每次仅约几毫克 3 ）对同一种镀膜材料，离子溅射镀膜质量好，能形成颗粒更细、更致密、更均匀、附着力更强的膜•对不导电的样品，最好在样品加工完毕后，立即蒸镀金或者碳等导电膜，镀膜后应马上分析，避免表面污染和导电膜脱落•金导电膜导电性好，二次电子发射率高，可以拍摄出质量好的图象如果成分定性、定量分析，必须蒸镀碳导电膜碳为超轻元素，对所分析元素的X 射线吸收小，对定量分析结果影响小蒸镀金可以用真空镀膜仪或离子溅射仪，蒸镀碳只能用真空镀膜仪。

镀膜要均匀，厚度控制在20nm 左右，为了保证样品与标样镀膜厚度相同，标样和样品应该同时蒸镀•真空镀膜仪在蒸镀过程中会产生1000°C－2000°C 的高温，而样品距蒸发源约为15mm 左右，对熔点低的有机物样品、生物样品及镶嵌材料等都会产生影响必须控制蒸镀时间，长时间镀膜不但温升影响样品，而且镀膜厚度增加会影响定量分析结果如果金膜太厚，金粒子会聚集成岛状结构，在高倍图象观察时产生假象，同时也会覆盖样品的微细结构为了控制镀碳膜厚度，最简单的方法是在镀膜样品的附近放一块经抛光的黄铜，用黄铜表面镀膜后的干涉色判断膜厚，20nm黄铜表面的干涉色为蓝紫色比较两种镀膜方法比较项目离子溅射法真空镀膜法要求真空度低（0.01-0.1乇）高（0.5乇）镀膜材料金、铂金银铜铝碳能否喷碳膜不能能镀膜附着力强弱控制镀膜厚度容易较难二次电子获取量较多一般样品损伤程度较大样品污染黑化污染一般无6.3.2导电染色 导电染色法是一种将极细小的金属颗粒植入生物样品中，以增强样品导电性的染色过程它要求染液既不污染样品，又能完好保存组织的精细结构，并且使样品有良好的导电性经导电染色的样品在扫描电镜下能释放较多的二次电子从而加强图像的亮度和反差。

特别是对于一些需要进行血管灌流或穿刺灌流的动物组织样品，如：心脏、气管、肠管胃等，最好进行导电染色，使在清洗样品的同时，又能提高样品的导电性能 常用的导电染液由缓冲液/固定液配制而成，同时具有固定作用•单宁酸/锇酸： 基于特殊的分子结构，单宁酸对酸性和中性溶液中的蛋白质具沉淀作用，对一些金属酸或金属盐类具有还原作用特别是单宁酸/锇酸同时存在的情况下，单宁酸和锇酸结合，形成单宁酸—锇酸复合物，使单宁酸/锇酸混合液除了具有固定作用之外，又能将金属颗粒植入生物样品中但需要注意的是，用单宁酸/锇酸处理样品之后，一定要彻底清洗，以防止污染 一般用0.1mol/l的磷酸缓冲液或二甲胂酸钠缓冲液配制单宁酸/锇酸导电染液，单宁酸的浓度燥0.5％-4％之间，锇酸的浓度燥0.1％-1％之间，可以根据样品的需要进行选择为防止为例污染新配制的单宁酸溶液，最好在过滤后使用染色时间根据样品的大小来确定，对于3mm3左右的组织块，须用导电液在室温下或4摄氏度下处理1-2h，而单细胞只处理10-30分钟就可以了经过导电染色处理的样品，可以省略金属镀膜有人对导电染色后的样品进行镀膜和不镀膜的比较观察，发现图像在亮度和反差方面没有明显的区别。

•锇酸：常用1％OsO4/缓冲液作为后固定液，一般4摄氏度下处理10分钟至1h因为锇酸含金属锇颗粒，对生物样品中的某些蛋白质有亲和性，所以在固定样品的同时，向样品中植入了金属颗粒，因而增强了样品的导电性锇酸对组织的渗透性不强，与戊二醛的前固定相比较，往往需要更长的时间，但锇酸处理的时间过长，又会腐蚀破坏生物样品的精细结构，使之产生空洞所以要根据样品的具体情况，灵活掌握用锇酸处理的时间扫描电镜观察样品整体表面一.直接观察法：这种方法比较简单、快捷，对样品的损伤较少，虽然在分辨力上受一定的限制，但也比较常用下面介绍两种直接观察法1.固体样品的直接观察法：对于含水少，本身就比较干燥且有有定导电能力的固体样品，如：骨骼、牙齿、矿石、土壤、干果、竹木以及植物的干标本等，可以直接用导电双面胶带将样品粘到样品台上，省略喷涂就可以用扫描电镜观察但要注意以下几点：（1）样品的底面应尽量平整，以扩大与样品台的接触面，改善导电状况如果需要，可在粘样品之前适当修整样品的底面2）用这种方法的图像分辨力不高，在调试仪器时应选择较低的加速电压（约5KV），并且放大倍数为几百倍为宜3）如果图像的质量不行，可以适当进行导电喷涂。

•2.活体样品的直接观察法：对于一些体积小，且含水少的活的昆虫等样品，如：蚊子、蚂蚁、螨虫、蛾等，也可以省略化学固定等一系列步骤，使之在生活状态下就可以在扫描电镜下观察，具体步骤如下：•（1）取样：注意不要碰伤样品•（2）清洗：用生理盐水或PBS洗1-3次注意不要致死样品，清洗液的pH值与样品本身的一致如果样品干净可以不清洗•（3）粘样：用导电胶带将样品粘在样品台上，注意既要粘牢，防止样品脱落阻塞通道，又要使样品能轻微运动•（4）观察：一般用低电压（2-5kV）注意操作要熟练，迅速抓住时机在20分钟之内拍照完毕因为在真空状态下，活体样品内的水分易蒸发，从而导致样品收缩变形甚至死亡有的扫描电镜配有高速摄影和录相装置，可以获取样品的动态变化图像，如：细胞分裂的全过程等二、游离细胞的观察法 用扫描电镜观察游离细胞的表面结构已相当普遍，样品制备的关键是如何把样品粘在样品台上，具体方法很多1.滤纸吸附法：用1％戊二醛/缓冲液固定，1000r/m 离心10分钟，去上清液将细胞的浓悬液滴在一小片滤纸上，系列乙醇脱水，临界点干燥，喷涂后观察这种方法简便易行，但图像容易混杂滤纸的显微2.金属片法：与第一种方法类似，只是改为将细胞 浓悬液滴在有微孔的金属片上，再进行一系列操作。

3.玻璃片法：现在盖玻片上镀一层金属膜以减少放电现象，改善观察效果再把浓细胞悬液（此时已经过每步离心脱水到100％）滴到玻片上，接着进行干燥或把盖玻片浸入0.3-0.5％孚尔瓦/氯仿液中，约10s后取出，自然干燥，使玻片上均匀地涂上一层膜，容易吸附细胞，再按照前法操作三、常规方法1.取材：取材准确、体积不宜过大，以减少不必要的观察量2.固定：一般双固定，即戊二醛前固定，锇酸后固定3.清洗：生理盐水或缓冲液4.系列乙醇脱水和醋酸异戊酯置换5. 干燥：临界点干燥、空气干燥、冷冻干燥等6.导电处理：离子溅射或真空喷镀扫描电镜样品断裂面结构的观察•为了扩大扫描电镜的应用范围，越来越多的研究工作者采用不同的方法，用扫描电镜揭示组织块和细胞等样品断裂面的超微结构，得到的图像立体感强更加逼真，并且可与透射电镜的观察效果互补长短液氮冷冻割断法：•1.一般方法：•A冷冻：把已干燥好的样品浸入液氮，或放在已经用液氮制冷的金属块上冷冻•B割断：用双面刀片把样品切成两块•C喷涂：把样品粘在样品台上，注意断裂面朝上，再真空喷金•2.使用扫描电镜冷冻切割装置•附设在扫描电镜上的冷冻割断装置由冷冻剂罐、冷刀装置、预冷真空控制装置、样品台调节装置、温度控制装置和观察窗等组成。

用这种装置，可连续地进行样品的冷冻、割断、喷涂和观察等一系列操作程序如下：•A冷冻：将样品安放在一个金属台支架上，用样品携带杆固定好后，迅速放入液氮冷冻（使用样品携带杆可以减少样品表面的结霜）•B断裂：用样品携带杆把预冷的样品送入扫描电镜的冷冻割断小室中，用到断裂样品小室与冷冻剂罐相连，使样品台和刀都制冷）•C喷涂：通过调节加热控制装置，使样品的断裂面升华，接着用喷金装置喷涂，这一步可以提高样品的导电性和图像的反差•D观察：接着将样品送入扫描电镜的样品室，就可以观察了3. 树脂冷冻割断法这种方法容易掌握，应用也比较广泛可选用多种树脂，如：EPON812等在操作过程中共同的问题是，既要防止树脂聚合，又要使树脂固化，所以采用冷冻方法处理样品具体步骤如下:A修样：取新鲜组织，切成1mm*1mm*5mm的棒状B固定和脱水:常规方法C置换：将样品浸入氧化丙烷30min，在换氧化丙烷/树脂混合液浸数小时D包埋：医用2号胶囊中注满树脂（注意不含加速剂），在放入样品，9-12hE固化：－80度下固化，可用液氮或乙醚/干冰等冷冻剂F割断：用刀具等在木板态上槌打 槌打时用力要适当，使断面平整 光洁犹如玻璃为佳。

G脱树脂：将割断的样品浸入氧化丙烯中处理2h，其间换3-5次新鲜的氧化丙烯，以彻底洗去样品中的树脂H按照常规方法临界点干燥和喷涂其它割断方法•1.苯乙烯树脂割断法：•这种方法的特点是操作简单，一方面包埋树脂要完全聚合，所以样品可保存较长时间；另一方面样品易被断裂，包埋的树脂也好溶解，所以应用比较广泛特别对于较微小的样品，方向性较强的样品和用其它方法不易断裂的较硬的样品，如：结缔组织、软骨等更加适宜具体步骤如下：（1）修整样品，常规方法固定、脱水2）置换：将样品浸入1：1乙醇/苯乙烯单体混合液中30min，在于-4度下用苯乙烯单体处理约12h3）包埋：向苯乙烯单体中加入2％-3%的过氧化苯乙酰，充分搅拌均匀之后，注入 以放有样品的医用胶囊中，随机盖好4）聚合：60度，24h以上5）割断：先剥去胶囊，在用割断器操作6）脱树脂：将割断的带有树脂的样品投入氧化丙烯中，约2h，期间换3-4次氧化丙烯7）置换和干燥：用乙酸异戊酯处理20min以上，临界点干燥游离细胞割断法：（1）固定：采用低浓度短时间的固定较好如：1％戊二醛/0.1mol/l磷酸缓冲液，10-30min2）离心：1000g，10min，离心成团，去上清液。

3）加固：按体积1：1加入蛋清，搅拌均匀，使之成为蛋白/细胞混合液4）后固定：用滴管缓缓加入戊二醛固定液，固定2h以上，直到蛋白从表面到底部都变硬，期间可换几次新鲜的固定液5）修整：取出蛋白/细胞混合块，用双面刀片切成小条6）割断：可选任意一种方法，操作同组织块一样超高压电镜样品的制备•超高压电镜电子束的波长更短，速度更快，穿透力比普通透射电镜要强得多对于较厚的生物样品，亦能穿透，并且既能增加图像的立体感，又不影响图像的分辨力，所以可用超高压电镜观察比较厚的样品但由于透射电镜的场深比较大，较厚的样品中各层次都会在焦使图像包含的内容过多，最终影响图像分析的质量所以，超高压电镜在生物领域应用不十分广泛只作简单介绍一、厚切片的制备•一、制备厚切片的原则 厚切片指1.5-3微米的厚切片制备厚切片的过程与普通超薄切片相似，只是在某些步骤有一些特殊的要求第一，样品块相对要软一些，以便连续切片和保护刀口；第二，要用较厚的支持膜，并喷碳加固，以防电子束的轰击；第三，可选用折叠式的单缝载网，以防止切片从载网上脱落；第四，最好用浸没法染色，且染色的时间可适当延长，以便使染液浸透样品此外，在包埋之前进行块染，亦能加强染色的效果。

在这些基本原则的指导下，可以根据具体条件选用可行的办法制备厚切片的方法1.取材与固定；与超薄切片近似，用2％－5％多聚甲醛或戊二醛在室温下固定1-3h，1％锇酸后固定 30min－1h2.块染（需要时加用）：用醋酸双氧铀/乙醇饱和溶液或2％磷钨酸/乙醇溶液，在室温下浸没样品块1-2h，可增加图像的反差3.脱水：用系列梯度乙醇或丙酮脱水4.包埋与聚合：用812，这种包埋剂聚合后较软，又有一定的韧性为了加强染色效果，可用5％醋酸双氧铀/75％乙醇溶液，在60度下浸泡聚合好的包埋块，24-36h5.准备载网：（1）载网的选择：因为厚切片不易粘牢，所以可选用折叠式载网这种载网可把切片夹住以防脱落但是这种载网不易覆盖支持膜，电镜观察时切片在电子束轰击下容易漂移或开裂解决的办法之一是用普通单缝载网，并覆盖较厚的孚尔瓦/碳膜另外，在电镜操作的时候，注意电子束斑的调节要得当，防止过亮（2）载网的清洗：为了把样品粘牢和防止污染，一定要彻底清洗载网，尤其是旧网具体办法是：先把载网浸入去污剂中，用超声波清洗；再用重蒸水冲洗；接着用100％丙酮冲洗最后，为解决捞片难的问题，还可以对载网进行辉光放电处理3）制备支持膜：与制备超薄切片中的相似，但需制备较厚的支持膜，改用0.8％孚尔瓦/二氯乙烯溶液，并真空喷镀20-60nm厚的碳膜。

6.切片与捞片：程序与超薄切片相似，只是调解切片的厚度和切速有所不同用切片的干涉色来判断切片的厚度，紫色以上为宜捞片时注意，如果用单缝载网捞连续切片，一定要对正，使切片局域单缝中，否则就观察不到了另外，如果载网经一系列清洗后仍有静电排斥切片，不易捞取和粘牢，可以先在1％异丁烯/二甲苯溶液中浸一下，在进行捞片7.电子染色：用浸泡染色法，使厚切片的上下两面都能浸透染液，可加强染色效果并适当延长染色时间，用饱和醋酸双氧铀染1-2h，用柠檬酸铅染30-60min二、制备整装样品•整装样品是指经过一系列处理后，直到电镜观察，始终保持完整状态的样品即：不经过切片和断裂等破坏性处理的样品用超高压电镜观察的整装生物样品多是完整的细胞或细菌等因它们的直径已足够小，超高压电镜可以穿透，不必切片亦能进行观察下面以整装细胞的样品制备为例，介绍具体方法•一、准备工作1.载网的准备：载网上覆盖孚尔瓦膜并喷碳膜加固，紫外线照射灭菌2.培养细胞：把载网的膜面朝上，浸没载培养液中，并接种培养的细胞，载37度温箱中培养3-4天，注意无菌操作二、电镜样品制备程序1.清洗：用吸管缓缓吸掉培养皿中的培养液，载注入缓冲液静置5min以洗去细胞表面多于的培养液。

2.前固定：先洗去缓冲液，载注入戊二醛 在室温下固定20-30min3.清洗：同1.4.锇酸后固定5.清洗6.脱水:系列乙醇梯度脱水8.临界点干燥9.电镜观察电镜观察•在从事电镜是工作中学会观察也是很重要的首先，要有正确的态度和方法，既要洞察每一个细节，又要抓住每一个主要目标，还要善于分析，区分真伪另外，观察之前还需要了解和掌握定的有关超微结构方面的基本知识和电镜拍照的方法观察的原则和技巧•一、树立全局的和立体的观点•电镜样品很小，如：超薄切片的载网直径只有3mm，扫描电镜的你股票虽然大些但也不过几个厘米因此，对于千万的整体来说，小小的电镜样品只代表你观察样品极小的一个侧面认识到这一点在电镜观察和分析时候就不会一叶障目，而是把观察到得结果和实际联系起来思考和分析例如：在某一个细胞的超薄切片中没有观察到中心粒，不能轻易下结论在这种细胞中不存在中心粒的结论另外，超薄切片是二维的样品，观察时要尽量从立体效果 去想象和分析因此，为了正确地分析观察到得资料，必须树立从全局的和立体的观点•2.观察的技巧•电镜观察犹如大海捞针，决不能走马观花，一定要严谨认真，否则精华的东西很可能就从您的眼下溜过了，而且很可能再也找不回了。

在加上已做好的电镜样品用肉眼和光学显微镜都看不出个所以然来，只有到电镜下观察时，才知道样品的优劣，所以在观察时，最好先用低倍（200-800）纵观全局，找到样品的优质区（厚度适宜、均匀平展、无污染无空洞和漂移）等，并由此开始依次观察，当发现重点目标时，再局部连续放大这样做既可以提高观察的效果，减少盲目性另外，样品在电子束的轰击下是很容易损伤的，特别是超薄切片，极易破裂、变形和曲卷为了为了把握住有用的资料，特别是难得的结构，最好先按低倍至高倍的顺序拍照，在仔细观察和相互讨论以免在热烈讨论分析中样品在电子束的轰击下破裂毁于一瞬对于同一个视野，先拍低倍好片，再拍高倍照片因为在拍高倍照片是电子束流集中在一个很小的区域轰击，容易造成热损伤，再转到低倍时会发现刚拍过的区域形成一个圆的明亮区，使拍照的视野亮度不均匀由此看来，电镜观察时，要掌握先低倍在高倍以及先拍照再据需观察和讨论的技巧电镜观察中人工假象和原因与识别•电镜样品的制备过程是复杂的，要经过多种处理，难免使样品受到这样或那样的损伤另外观察过程中电子束的轰击也会使样品造成不同程度饿损伤在加上其他因素，如：聚焦和象散，往往使拍出的照片显示不出样品的真实情况。

我们把这类图像统称为人工假象产生人工假象的原因很多，但总的可以划分为两类：一类是样品制备的原因，一类是电镜观察的原因•样品制备的过程的原因•制备样品的方法不同，引起损伤的原因也不同，如：在制备超薄切片过程中，最容易造成损伤的因素是固定、脱水、修快、切片和染色在制备扫描电镜样品的过程中，最容易在成损伤的因素是干燥和喷涂，在制备冷冻蚀刻的样品中容易造成损伤的因素是冷冻、断裂、喷涂和清洗等只有把握好每一个制样的环节才能尽可能的减少损伤•2、电镜观察的原因•这主要和电镜的调试和操作有关电镜观察之前，要把仪器的状态调节到最佳，使能清晰成像和无畸形如果光阑或透镜受到污染，使电子束的通道受阻，就会形成象散，即：图像失真，使高放大倍数时图像模糊不清观察过程中，过强的电子束轰击样品时，会使样品受热，结果一方面使包埋的材料升华，导致结构模糊；另外，使样品极度扩张，会使样品撕裂，进而还会引起样品的漂移和卷曲最终导致无法观察和拍照另外，聚焦不当也会影响照片的质量，一般认为肉眼聚焦好之后，恰是欠焦状态因为欠焦时物象的周围显现一种衍射环，使反差有所增加，但同时却降低了分辨率，为了妥善解决反差和分辨率的矛盾，一般先稍欠焦拍照，或正焦、欠焦和过焦条件下各拍一张，冲印出来后在选择。

手指纹手指纹。