昭通天麻dna条形码研究及药用成分分析.pdf

秀旬中遽雪尚 硕士学位论文 昭通天麻D M 条形码研究及药用成分分析 教学单位史药堂陵 研究生姓名廑科医 学科、专业虫药堂 学位类型堂苤亟±堂僮 指导教9 i l i毯王刨麴撞 完成日期二一三年五月 昭通天麻D N A 条形码研究及药用成分分析 云斛医学院糊文独创性声明嘲磐燃 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果，无抄袭及编造行为除文中已经特别加以注明引用的内容外， 本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果对本文做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标注并致谢本人完全意识到本声明 的法律结果并由本人所承担的法律责任 学位论文作者签名：巫塑型日期：砬年—上月上日 云南中医学院学位论文使用授权声明 云南中医学院有权保留使用本人学位论文，同意学院按规定向国家有关部门 机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅本人授权云南中医学院可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复印手段保存或汇编本学位论文可以公布( 包括刊登) 论文的全部或 部分内容 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名 学位论文导师签名 本人及导师同 日期：兰立年—L 月j L 日 日期：塑! 至年上月』日 清华大学“中国学术期刊( 光盘版) 电子社” 进行电子和网络出版，并编入C N K I 系列数据库，传播本学位论文的全部或部分 内容，同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权 益。

学位论文作者签名： 学位论文导师签名： 日期：塑! ! 年—L 月—L 日 日期：塑! ≥年厶月上日 目录 目录 摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一I A b s t r a c t ．⋯⋯⋯⋯．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯．⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．．⋯．I I I 英文缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯v I 引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 第—章天麻的分类研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 1 ．天麻植物的分类学简史⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 1 ．1 天麻的本草考证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～3 1 ．2 我国天麻属植物的分类学研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 1 ．3 天麻属植物形态特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一6 1 ．4 天麻及其种下变型的分类概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7 2 ．昭通天麻的来源组成及特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9 3 ．昭通天麻3 个变型块茎的表型性状分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，．1l 3 ．1 实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l 3 ．2 实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11 3 ．3 统计结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12 4 ．小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。

15 第二章昭通天麻D N A 条形码研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．17 1 ．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．17 1 ．1 实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l7 1 ．2 主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18 1 ．3 主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 9 1 ．4 主要溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 9 1 ．5 实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 1 ．6 数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 5 2 ．结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2 6 2 ．1 改良C T A B 法提取天麻不同部位D N A ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2 6 2 ．2 天麻药材总D N A 提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 8 2 - 3 P C R 扩增效率及测序成功率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 8 2 ．4 数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 5 3 ．小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4 6 第三章昭通天麻药用成分分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5 0 1 ．仪器与试药⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一5 0 昭通天麻D N A 条形码研究及药用成分分析 1 ．1 仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一5 0 1 ．2 试药⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～5 0 2 ．方法与结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一5 1 2 ．1 天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 1 2 ．2 腺苷和对羟基苯甲醛的含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 7 3 ．小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6 3 第四章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 6 第五章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 8 1 ．植物D N A 条形码的研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 8 1 ．1 D N A 条形码技术的概念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6 8 1 ．2 植物D N A 条形码候补片段的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6 9 1 ．3 D N A 条形码技术鉴定流程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7 2 2 ．兰科植物D N A 条形码的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 2 3 ．天麻属的研究背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一7 3 3 ．1 天麻的本草考证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 3 3 ．2 天麻种质资源研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 4 3 ．3 天麻不同变型的分类鉴定及亲缘关系研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 7 3 ．4 天麻共生菌研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 7 3 ．5 天麻的化学成分研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 9 参蔫E 妇献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8l 附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8 7 致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一9 5 摘要 昭通天麻D N A 条形码研究及药用成分分析 唐科民( 中药学专业) 指导教师：钱子刚教授 摘要 天麻( G a s t r o d i ae l a t aB 1 ．) 隶属于兰科( O r c h i d a c e a e ) 、兰亚科( S u b f a m ． O r c h i d o i d e a e ) 、树兰族( T r i b ．E p i d e n d r e a e ) 、天麻亚族( S u b t r i b ．G a s t r o d i i n a e ) 天麻属( G a s t r o d i aR ．B r ．) 腐生草本植物，无根无绿叶，与蜜环菌( A r m i l l a r i am e l l e a ( V a h le xF r ．) K a r s t ．) 共生。

天麻以块茎入药，是主产于我国的名贵中药，在我国 已有两千余年的用药历史《中国植物志》记载天麻属在我国分布有1 3 种，昭通 地区所分布的主要为天麻( G ．e l a t aB 1 ．) 的4 个变型，即红天麻( G ．e l a t aB 1 ．￡ e l a t a ) 、绿天麻( G ．e l a t aB 1 ．f ．v i r i d i sM a k i n o ) 、乌天麻( G ．e l a t aB I ．f ．g l a u c a S ．C h o w ) 、黄天麻( G ．e l a t aB 1 ．ff l a v i d aS ．C h o w ) 本文综合应用了形态学、 D N A 条形码技术和化学成分分析等手段和方法对昭通天麻黄、绿、乌3 个变型 的分类进行了研究此外，我们也对昭通天麻不同变型共生真菌的种类进行了探 讨，主要研究结果如下： 1 ．天麻的形态分类研究 昭通天麻植物形态特征差异明显，从株高、花色、茎秆颜色以及块茎表型性 状可直观对天麻3 个变型——乌天麻、黄天麻、绿天麻进行形态分类3 个变型 天麻块茎表型性状具有一定程度的多样性乌天麻个体较大，与黄天麻和绿天麻 差异明显，且乌天麻遗传变异稳定，可作为栽培天麻的优质种源。

天麻块茎各表 型性状变型间变异大于变型内变异，从这个意义上来说，变型间变异是天麻的主 要变异来源；天麻药材由于经过加工炮制，3 个变型之间的药材形态特征已经很 接近，形态鉴别困难 2 ．昭通天麻的D N A 条形码研究 分析比较了I T S 、m a t K 、r b c L 、t r n H - p s b A 、t r n L —F 五个D N A 条形码候选序 列在天麻不同变型内和变型间的鉴别效果，并对组合片段I T S + r b c L 的鉴定效果 进行了评估在天麻I T S 、r b c L 、m a t K 和t r n H - p s b A 基因中，仅I T S 和r b c L 得 到扩增，但变型内变型间没有明显的b a r c o d i n gg a p ，上述通用条码不适合作为昭 T 昭通天麻D N A 条形码研究及药用成分分析 通天麻种下变型D N A 条形码的研究，但是I T S 序列可作为不同居群天麻的分子 鉴别研究；叶绿体基因片段r b c L 和t r n H - p s b A 的成功扩增，推测天麻叶绿体仍 未退化完全 从I T S 序列分析得出，黄天麻与乌天麻亲缘关系最近，其次是绿天麻与黄天 麻，乌天麻与绿天麻亲缘关系最远；天麻I T S 序列在变型内和变型间大部分个体 变异较小，仅有少部分个体变异较大，变异主要发生在I T S l 区；就变型内来说， 绿天麻的遗传变异最大，乌天麻和黄天麻遗传变异较小，乌天麻和黄天麻遗传稳 定，有利于天麻的遗传育种。

昭通天麻与贵州大方天麻的亲缘关系较近，而与陕 西汉中天麻的亲缘关系却相对较远，不同来源相同变型天麻的I T S 序列差异明显， 而相同来源不同变型间的I T S 序列同源性较高 天麻共生菌不是单一的蜜环菌( A r m i l l a r i am e l l e a ( V a h le xF r ．) K a r s t ．) ，大部 分是蜜环菌属( A r m i l l a r i as p p ．) 的其他种，各蜜环菌种与各变型天麻的共生并 非一一对应关系天麻共生菌可能还含有小菇属( M y c e。