第五章 应用(二)煤的微生物转化.doc

2014年3月14日星期五10时43分27秒第五章 煤的微生物转化 1意 义★ 我国是世界上最大的产煤国和消费国中国煤炭工业可持续发展的出路就是实施中国洁净煤战略★ 传统的煤化工企业（煤炭气化和煤炭液化），建设和运行成本高昂，是典型的高能耗、高危险及高污染的“三高”企业★ 煤炭工业必须走 “绿色”煤炭转化之路——煤炭生物降解转化技术，这样既符合我国的国情，又符合洁净煤技术的国际发展方向，是我国能源可持续发展的一条必由之路★ 当前我国已成为石油进口和消费绝对水平的国际第二大国，增量水平上的头号大国国家战略安全决定了我国能源战略必须立足国内优势煤炭资源走以煤代油、煤炭绿色转化之路所以本课题研究有着十分重要的意义2定 义★ 煤的生物转化（Bioconvertion or Biotransformation）是属煤炭生物加工的范畴，是指煤在微生物参与下发生大分子的解聚作用，称之为生物降解转化或生物溶解（Biodegradation or biosolubilization），主要是利用真菌、细菌和放线菌等微生物的转化作用来实现煤的溶解、液化和气化，使之转化成易于溶水的物质或者烃类气体，从中进一步提取或者转化有特殊价值的化学品以及制取清洁燃料、工业添加剂及植物生长促进剂等。

3可 行 性★ 煤炭生物转化的可行性：煤，石油和木质素三者在大结构组成的同源性以及某些微生物在碳素循环的特殊性决定了煤炭生物转化的可能性★ 煤微生物转化研究于20世纪80年代初始于德国F.V.Fakoussa博士和美M.S.Cohen教授分别报道了某些真菌能在煤块上生长，将煤溶解转化成黑色水溶液4降 解 菌 种★ 煤炭生物降解转化菌种： 研究发现对煤炭具有降解转化功能的菌种有：细菌类有Pseudomonas cepacia strain DLC-07等；放线菌类有Streptomyces setonii 75Vi2等；真菌类的担子菌属中有Phanerochaete chrysosporium等；酵母菌中的一些种及丝状真菌中的Aspergillus sp.等 在这些种属中，云芝、青霉、假单胞菌的液化能力较强 5意 义★ 当前，煤炭生物转化国内外大多停留在菌种的筛选和常规诱变上★ 利用基因工程的手段构建能够降解特殊化合物超级工程菌是微生物方向前进据报道美国就已用4种假单胞细菌的基因组入到同一菌株中，创造了有超常降解能力的超级菌，其降解石油的速度奇快，几小时能够分解石油中三分之二的烃类，而自然需要一年多才行。

★ 故本课题采用一些具有不同降解原理的菌种进行细胞融合、基因重组方面的研究，力求从根本上改造煤炭的降解转化菌种★ 利用基因工程的手段构建煤炭降解转化高效工程菌是本论文的特色6微生物溶煤试验方式及溶煤反应器固体表面溶煤操作方法把配制好并热溶的固体琼脂培养基分装在表面皿或试管中，灭菌，试管摆斜面菌种接种于固体面层上待菌丝长满或快长满整个表面时把试验用煤样加在菌丝面层上然后观察、记录现象，收集液体产物等 7微生物溶煤试验方式及溶煤反应器胞外液溶煤这种方法是用液体深层培养菌种实验室里一般用摇瓶培养待菌丝生长一段时间后．用真空过滤等方法收集菌体胞外液（即无细胞滤液），然后加入灭过菌的煤样进行溶煤优点：易于收集溶解产物．胞外液中不含菌体细胞．也易于深入考察溶煤过程和探讨溶煤适宜条件8微生物溶煤试验方式及溶煤反应器细胞液溶煤煤样直接加入培养液中，菌体、煤样、培养液直接接触煤样可以在接种时一并加入，或在培养一段时间后再加入待煤样溶解后再过滤或离心分离液体与固体菌丝体和未溶煤优点：易于放大，且操作过程简单，有应用的可行性 9溶煤微生物及可被微主物溶解的煤溶煤微生物（1）有的是细菌；（2）有的是放线菌；（3）大多数是真菌。

溶煤微生物的来源根据它们的代谢产物，如分泌的酶、螯合剂等具有攻击煤中或类似于煤的有机化合物中某些成分、结构等作用，而从现有的各种微生物中筛选出来的 从生长在暴露于自然界中的煤上的微生物中分离菌种 不同的微生物与不同煤样的作用有一定的匹配关系因此，不同煤种的溶煤微生物的筛选就显得非常重要 10可被微主物溶解的煤可被微生物溶解的煤的种类 分化煤和未分化的各种褐煤、次烟煤、烟煤等 煤的微生物溶解程度与煤的氧化程度关系 煤的微生物溶解程度由大到小的顺序为：1）分化煤；2）暴露在空气中的煤；3）未暴露在空气中的煤 泥炭 而未经处理的泥炭难于被微生物降解 煤的氧化程度被作为煤种筛选的一个重要因素 11微主物溶煤活性物及溶煤机理溶煤活性物 微生物分泌的溶煤活性物可能为酶、碱、多肽、聚胺、表面活性剂、螯合剂或其他的化学物质根据溶煤活性物的不同，研究者提出了碱溶机理、酶作用机理、螫合物作用机理、表面活性剂作用机理等煤的生物溶解过程是一个复杂的化学反应过程，菌种不同，溶煤活性物不同；同一菌种在不同的培养基中，对不同的煤样，其分泌的溶煤活性物也可能不同 12微主物溶煤机理★ 自开展此项研究以来，专家学者们对此提出了多种机理，到目前为止，煤炭微生物降解转化的机理被人们所公认的主要有三种，即碱作用机理、生物螯合剂的作用机理、生物酶作用机理。

13微主物溶煤机理生物酶作用机理★真菌生物降解转化煤炭机理探讨 ： 黄孢原毛平革菌具有木质素降解酶系统（ligninolytic enzyme system）或木质素修饰酶系统（lignin modifying enzymes,LME） 1. 木质素过氧化物酶（Lip）： Lip通过催化酚类、非酚类物质氧化，参与木质素解聚2. Mn过氧化物酶（MnP）： MnP氧化大量的酚类底物；如胺类、染料，在木质素解聚中有重要作用3. 漆酶（Lac）： 以酚类化合物为底物虽然一度认为Lac对底物的进攻主要局限于酚类化合物，现以证明，它对于许多非酚类物质如蒽、苯并芘、多环芳烃等同样有高度的进攻性还参与木质素的解聚和降解Lac催化C－C键、C－O键的断裂，催化脱甲基、解聚和聚合反应14微主物溶煤机理★ LiP的催化循环 ： LiP + H2O2→LiPⅠ+ H2OLiPⅠ+AH2→LiPⅡ+ AH•+LiPⅡ+ AH2→LiP + AH•++ H2O过氧化物酶的催化循环　Lip的催化氧化有机物（AH）机理15★ MnP的催化循环 ： MnP+H2O2→MnPⅠ+ H2OMnPⅠ+ MnP(Ⅱ)→MnPⅡ+ MnP(Ⅲ)MnPⅡ+ MnP(Ⅱ)→MnP+ MnP(Ⅲ)+ H2OMnP的催化循环生物酶作用机理16锰过氧化物酶（MnP） 黄孢原毛平革菌的MnP对酚类木质素模式二聚物的降解产物17微生物溶煤产物分析及微生物溶煤产物的应用生物溶煤产物的分析基于现代煤化学和生物学的分离技术和分析手段，进行的有关产物组成、结构和性质的分析。

分析方法工业分析、元素分析、红外光谱、核磁共振波谱、质谱分析等也有用荧光、紫外线、气（液）相和凝胶色谱及凝胶电泳等方法 研究内容产物组成、产物结构、溶解度、分子量、酸沉淀性质、吸光度、蛋白质含量、发热量等．但结论各异18产物组成元素变化趋势 与原煤相比，煤的微生物溶解产物中H，O含量明显升高，而C含量下降，并且H，O的含量随溶煤时间的增加而增加 Faison等人指出，溶解产物中明显地富集了N，S，Na，Cl等元素19产物结构不同的煤种经同一种微生物作用后，其结构的变化并不完全相同但产物的结构特征仍与原煤类似 分子量及发热量平均分子量及分子量的分布目前尚无标准的测定方法研究者常用蒸汽渗透压法或质谱法测定平均分子量；用超滤膜或凝胶渗透层析法测定分子量分布一般认为．溶煤产物的分子量比原煤要小沉淀性及溶解性 微生物溶煤产物是酸可沉淀的其沉淀是可碱溶的 微生物的溶煤产物极易溶于水，较难溶于甲醇，明显不溶于砒啶 微生物溶煤产物分析及微生物溶煤产物的应用20微生物溶煤产物的应用溶煤产物含有多种官能团，具有较大的工、农、牧、医等方面的应用潜力 Faison等人提出．被木质素真菌所溶解的煤物质，可在工业上用于抗氧剂表面活性剂、树脂或黏合剂成分，特别是作商业离子交换树脂或吸附剂用； 在农业上用作土壤调节剂，改善植物根的吸收作用； 在医学上作为免疫辅药等。

Klein等建议，可将煤的转化产物合成聚羟基烯烃类的精细化学品 21煤的微生物转化研究的发展方向我国煤的微生物转化研究进展（l）溶煤菌种方面目前在溶煤菌种的寻求上还未取得突破性进展，尚未找到效果特别显著且适应广泛的廉价菌种 （2）在微生物溶煤产物的利用方面 由于煤本身结构的复杂性及煤微生物溶解产物的组成和结构的复杂性，要想直接得到结构单一的化学品有一定的困难目前溶煤液态产物只在用作农作物生长促进剂方面取得了一定进展 22煤的微生物转化研究的发展方向煤的微生物转化的主要研究方向 （1）寻求高效菌种；（2）开发溶煤新产品；（3）拓展溶煤产物的新用途 煤的微生物转化是煤的综合利用研究中的新领域，因而前景十分广阔 23本人的博士论文部分24黄孢原毛平革菌的生物学特征 图3-1 黄孢原毛平革菌培育生长曲线Fig.3-1 The growth curve of Phanerochaete chrysosporium25黄孢原毛平革菌的生物学特征 图3-2 黄孢原毛平革菌（固体培养基）图3-6 液体培养图3-4 镜检(×400)图3-5 特征反应图3-3 芽孢染色(×1000)26试 验 用 煤 样★ 试验用煤样是河南义马褐煤，煤样取自安徽淮化集团且堆放时间二年以上，原煤样经过烘干、破碎、筛分的每个程序，制备成能代表原来煤样的分析（试验）煤样。

试验用硝酸氧化义马褐煤煤样，用5N硝酸浸泡二天后，先用蒸馏水煮洗，洗掉硝酸，然后用2XZ－4型旋片式真空泵抽滤经硝酸处理过的煤样，直至抽滤滤液接近清水、近乎中性为止，烘干消毒备用粒度分三个粒级 3-0.5mm、0.5-0.2mm、-0.2mm★ 试验用硝酸氧化义马褐煤用2XZ－4型旋片式真空泵抽滤经硝酸处理过的煤样，直至抽滤滤液接近清水、近乎中性为止，烘干消毒备用 27黄孢原毛平革菌的紫外诱变及其煤炭降解转化实验研究 ★ 为了进一步提高黄孢原毛平革菌降解煤炭的能力，本实验采用紫外线作为诱变剂，对黄孢原毛平革菌进行紫外辐射处理★ 紫外诱变处理菌种，关键在于诱变剂量的选择，诱变因素包括紫外灯强度(功率)、紫外照射距离、紫外线处理时间等试验中采用固定紫外灯强度与照射距离，改变紫外线处理时间，从而实现诱变剂量的选择通过紫外诱变处理方式来诱变黄孢原毛平革菌，从而选择变异菌株★ 由于黄孢原毛平革菌的紫外辐射诱变菌种是选育黄孢原毛平革菌降解转化煤炭的进一步发展，故紫外辐射诱变菌株对煤炭降解转化的试验条件中未提及的试验条件及降解转化最优工艺路线都与3.2黄孢原毛平革菌用于煤炭降解实验研究中相同；在下一节黄孢原毛平革菌的微波辐射诱变菌种亦于此类同。

28实 验 结 果 与 分 析 图3-9 紫外辐射处理菌株图片辐射时间20。