6章蛋白质的功能与进化教学用.ppt

第第 6 章章蛋白质的功能蛋白质的功能与进化与进化一、蛋白质功能的多样性(自学)二、血红蛋白的结构三、血红蛋白的功能：转运氧四、血红蛋白分子病五、免疫球蛋白六、氨基酸序列与生物学功能教学内容二、血红蛋白的结构Ø光合作用光合作用→大气变化大气变化→氧气不断增加氧气不断增加→生物进化到以氧为基生物进化到以氧为基础的代谢础的代谢Ø进化中出现了两种重要的氧结合蛋白：肌红蛋白、血红蛋白进化中出现了两种重要的氧结合蛋白：肌红蛋白、血红蛋白Ø肌红蛋白适合氧的贮存、血红蛋白适合氧的运输肌红蛋白适合氧的贮存、血红蛋白适合氧的运输(一) 血红素(二) 珠蛋白的三级结构(三) 与O2结合的机制(四) 血红蛋白的四级结构二、血红蛋白的结构肌红蛋白和血红蛋白的辅基肌红蛋白和血红蛋白的辅基(一)血红素原卟啉原卟啉ⅨⅨ血红素，原卟啉血红素，原卟啉Ⅸ与还原型与还原型Fe2+的络合物的络合物(二)珠蛋白的三级结构Ø肌红蛋白（肌红蛋白（Mb）：）： 单体蛋白单体蛋白, 一一条多肽链和一个血红素辅基构成条多肽链和一个血红素辅基构成, Mr 17 000, 153个氨基酸残基个氨基酸残基Mb的脱辅基蛋白质称为珠蛋白的脱辅基蛋白质称为珠蛋白（（globin）。

ØMb主链：主链：8个个α螺旋区段，螺旋区段， 分别命分别命名为名为A、、B、、C…H；相应的非螺旋；相应的非螺旋区段区段(也称拐弯也称拐弯)为为NA(N-末端区段末端区段)、、AB、、BC…FG、、GH、、HC （（C-末末端区段）端区段）Ø氨基酸残基两种表示法：氨基酸残基两种表示法： His F8, 即从即从N端开始端开始His93(二)珠蛋白的三级结构血红素结合部位除内衬一层疏水残基外，还有两个血红素结合部位除内衬一层疏水残基外，还有两个 His 残基，残基，His E7 和和 His F8，， 它们在氧结合中起关键的作用它们在氧结合中起关键的作用(二)珠蛋白的三级结构His F8, 为近端组氨酸，其咪唑为近端组氨酸，其咪唑N成为血红素成为血红素Fe(Ⅱ)的第的第5配体当肌红蛋白与氧结合变成氧合肌红蛋白（当肌红蛋白与氧结合变成氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，，MbO2）时）时, Fe(Ⅱ)的第的第6 配位被配位被O2占据(二)珠蛋白的三级结构His E7,为远端组氨醯为远端组氨醯(distal His)，在血红素基与氧结合的一侧，在血红素基与氧结合的一侧,离血红素离血红素稍远，不与稍远，不与Fe(Ⅱ)成键，与成键，与O2分子紧密接触，使分子紧密接触，使O2轴不能垂直于环平面，轴不能垂直于环平面，约有约有60°的倾斜，因此氧结合部位是一个空间位阻区域。

的倾斜，因此氧结合部位是一个空间位阻区域(三)与O2结合的机制Ø水中游离的血红素也能与氧结合，但血红素水中游离的血红素也能与氧结合，但血红素Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)被氧被氧化成高铁血红素化成高铁血红素Fe(Ⅲ)Fe(Ⅲ)Ø肌红蛋白的疏水空穴中，可以避免与水接触，使血红素肌红蛋白的疏水空穴中，可以避免与水接触，使血红素Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)不易被氧化当与不易被氧化当与O2O2结合时发生暂时性电子重排，结合时发生暂时性电子重排，去氧后铁仍处于亚铁态去氧后铁仍处于亚铁态Ø血红素血红素- -血红素作用增强血红素作用增强Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)的氧化的氧化, , 珠蛋白氧结合珠蛋白氧结合部位的空间位阻使两个血红素基团不能靠足够近部位的空间位阻使两个血红素基团不能靠足够近, , 不易不易发生这种相互作用发生这种相互作用Ø空间位阻也降低血红素对空间位阻也降低血红素对CO的亲和力，游离的血红素结合的亲和力，游离的血红素结合CO比结合比结合O2的能力强的能力强25 000倍，而珠蛋白中血红素对倍，而珠蛋白中血红素对CO的亲和力的亲和力仅为对仅为对O2的的250倍肌红蛋白和血红蛋白凭借位阻降低了对倍肌红蛋白和血红蛋白凭借位阻降低了对CO的亲和力，有效地防止代谢过程中产生的少量的亲和力，有效地防止代谢过程中产生的少量CO的毒害。

的毒害Ø空气中空气中CO含量达含量达0.06%～～0.08% 即有中毒危险即有中毒危险,达达0.1% 则使人则使人窒息死亡窒息死亡Fe(Ⅱ)离子向卟啉环离子向卟啉环上方突出上方突出 0.06nmFe(Ⅱ)离子仅向卟啉环上离子仅向卟啉环上方突出方突出 0.02nm，同时牵，同时牵引引F螺旋移动，引起肌红螺旋移动，引起肌红蛋白构象变化蛋白构象变化Ø2个个α亚基和亚基和2个个β亚基杂四聚体亚基杂四聚体, 近球形近球形(6.4 nm ×5.5×5.0nm)，，也可看成由两个原聚体也可看成由两个原聚体(αβ)构成的对称二聚体构成的对称二聚体四)血红蛋白(Hb)的四级结构Ø去血红素的去血红素的α亚基和亚基和β亚基也属于珠蛋白家族，亚基也属于珠蛋白家族，α-珠蛋白珠蛋白(141个残个残基基)和和β珠强白珠强白(146个残基个残基)ØHb含含4个血红素，能结合个血红素，能结合4个个O2Hb中作为氧结合部位的空穴与中作为氧结合部位的空穴与Mb中的极相似中的极相似, 它们都有两个关键的它们都有两个关键的His残基残基(E7和和F8)和两个疏和两个疏水残基水残基(Phe CDl和和Leu F4)四)血红蛋白(Hb)的四级结构Ø和和Mb一样，一样，Hb上的氧结合部位也能可逆地与上的氧结合部位也能可逆地与O2结合而不结合而不使使Fe(Ⅱ)氧化，并且也降低了血红素与氧化，并且也降低了血红素与CO的亲和力。

的亲和力ØHb的四级结构带来的四级结构带来Mb没有的两个结构特点：没有的两个结构特点：(四)血红蛋白(Hb)的四级结构ββ2 2亚基缔合出现一个中央空亚基缔合出现一个中央空穴，为穴，为 BPG 结合部位结合部位αα1 1αα2 2ββ1 1特点一：特点一：装配接触：装配接触：蓝色部分蓝色部分滑动接触：滑动接触：黄色部分黄色部分特点二：特点二：Ø出现亚基之间相互作出现亚基之间相互作用区域，特别是用区域，特别是αα和和ββ之之间的接触界面的接触界面Øαα和和ββ接触有两种：接触有两种：①①HbHb半分子（半分子（αα1 1ββ1 1和和 αα2 2ββ2 2）中）中αα和和ββ的接的接触为装配接触；触为装配接触；②②半分子之间的半分子之间的αα和和ββ接触（接触（αα1 1和和ββ2 2、、 αα2 2和和ββ1 1）） ，滑动接触，滑动接触一、蛋白质功能的多样性(自学)二、血红蛋白的结构三、血红蛋白的功能：转运氧四、血红蛋白分子病五、免疫球蛋白六、氨基酸序列与生物学功能教学内容(一) 肌红蛋白是氧的贮库(二) 血红蛋白氧合的协同性和别构效应(三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态(四) 血红蛋白协同性氧结合的定量分析(五) BPG调节Hb对O2的亲和力(六) H＋和CO2调节Hb对O2的亲和力：Bohr效应三、血红蛋白的功能：转运氧(一) 肌红蛋白是氧的贮库 Mb与与O2结合的化学计量关系：结合的化学计量关系：氧解离平衡常数：氧解离平衡常数：[MbO2] 与与 [Mb] 之比之比 与与[O2]成正比成正比或或(一) 肌红蛋白是氧的贮库 氧分数饱和度氧分数饱和度Y或或根据根据Henry定律，溶于液体的任一气体的浓度与液体上面的该定律，溶于液体的任一气体的浓度与液体上面的该气体分压成正比：气体分压成正比：另一种表达另一种表达Mb与与O2的结合的化学计量关系：的结合的化学计量关系：P(O2)：可被调节和测量，单位：可被调节和测量，单位kPa（（1kPa=7.5torr 或或mmHg））Y：分光光度法测量：分光光度法测量氧结合曲线或氧解离曲线氧结合曲线或氧解离曲线当当 Y = 1 时，饱和时，饱和当当 Y = 0.5 时时, p(O2) = K = P50 或或 P0.5P50的定义：肌红蛋白被氧半饱和时的氧分压的定义：肌红蛋白被氧半饱和时的氧分压用氧分压和氧分数饱用氧分压和氧分数饱和度作图：和度作图：Mb 的氧的氧结合曲线是一等轴双结合曲线是一等轴双曲线曲线氧结合曲线或氧解离曲线氧结合曲线或氧解离曲线ØMb的的P50为为0.27kPaØ肌肉毛细血管中氧浓度约肌肉毛细血管中氧浓度约为为3kPa ；；Ø细胞内表面约为细胞内表面约为1.33kPa （（Mb80%被饱和）；被饱和）；Ø线粒体中为线粒体中为0~1.33kPa （（Mb25%被饱和）；被饱和）； 结论：结论：大多数情况，大多数情况，Mb是高度氧合的，氧的贮存库，有利于是高度氧合的，氧的贮存库，有利于细胞内的细胞内的O2从质膜向线粒体运转从质膜向线粒体运转ØHb，四聚体，通过亚基，四聚体，通过亚基-亚基相互作用调节它的氧合能力亚基相互作用调节它的氧合能力→引引出别构效应概念出别构效应概念Ø别构效应别构效应(allosteric effect)：：又称为变构效应。

又称为变构效应多亚基蛋白质多亚基蛋白质一般有多个配体结合部位一个配体与蛋白质上的一个结合一般有多个配体结合部位一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称别构部位的结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称别构效应具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白质效应具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白质, 如血红蛋白如血红蛋白Ø别构（或变构），原指蛋白质分子不止含有正常配体结合部别构（或变构），原指蛋白质分子不止含有正常配体结合部位位(如活性部位如活性部位)，尚有别的配体如调节物或效应物结合部位，尚有别的配体如调节物或效应物结合部位——调节部位或别构部位别构蛋白质的调节物可以是激活调节部位或别构部位别构蛋白质的调节物可以是激活剂或抑制剂剂或抑制剂二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应Ø别构效应：有同促别构效应：有同促[别够别够]效应和异促效应和异促[别够别够]效应两种情形效应两种情形Ø同促同促[别构别构]效应：效应：调节物和正常配体是同一种分子，发调节物和正常配体是同一种分子，发生相互作用的部位是同种的，一个配体的结合影响同种生相互作用的部位是同种的，一个配体的结合影响同种配体与其余同种空位的结合能力，一般使亲和力加强配体与其余同种空位的结合能力，一般使亲和力加强——具有协同性或正协同性。

具有协同性或正协同性Ø正协同正协同[同促同促]效应表现为效应表现为S形配体结合曲线，正协同结合形配体结合曲线，正协同结合使蛋白质对配体浓度的应答更为敏感负协同使蛋白质对配体浓度的应答更为敏感负协同[同促同促]效效应，它不呈现应，它不呈现S形曲线二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应Ø异促效应：调节物是正常配体以外的分子，异促效应：调节物是正常配体以外的分子， 发生作用的发生作用的部位不是同种的，即正常配体的结合行为受到另一种配体部位不是同种的，即正常配体的结合行为受到另一种配体(调节物调节物)与另一种部位与另一种部位(别构部位别构部位)结合的影响结合的影响Ø血红蛋白有正常配体结合部位和调节物结合部位血红蛋白有正常配体结合部位和调节物结合部位, 既有同既有同促效应又有异促效应促效应又有异促效应O2 可被认为是可被认为是Hb的正常配体又是的正常配体又是同促调节物，同促调节物，BPG是异促调节物是异促调节物二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应(三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态 ØHb有两种可结合氧的互变的构象状态，有两种可结合氧的互变的构象状态，T态、态、R态ØT态，去氧态，去氧Hb主要构象；主要构象； R态，氧合态，氧合Hb主要构象。

主要构象(三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态 Ø8个盐桥个盐桥ØBoth α- and β-subunits have Tyr as the penultimate C-terminal residue (Tyr 140 ＝＝ Tyr HC2; Tyr 145 ＝＝ Tyr HC2，，respectively)酪氨酸酪氨酸-OH 与与 Val FG5 (Val FG5 is α93 andβ98，，respectively) 形形成氢键；成氢键；缺氧时缺氧时 T 态的被稳定：态的被稳定：(三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态 ØThe shift in helix F upon oxygenation leads to rupture of this Tyr HC2:Val FG5 hydrogen bond. Further, eight salt bridges linking the polypeptide chains are broken as hemoglobin goes from the deoxy to the oxy formØHb半分的彼此滑动、旋转，使半分的彼此滑动、旋转，使β亚基之间的空穴变窄，致使亚基之间的空穴变窄，致使BPG，进，进入入R状态，状态，O2被结合被结合有氧时，有氧时，O2与与T态态 Hb 结合结合→：：Ø1910，，Hill A 对血红蛋白与对血红蛋白与O2的协同性结合作过定量分析。

的协同性结合作过定量分析Ø暂设暂设O2与与Bb的结合是一种的结合是一种“全或无全或无”的现象四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析则解离平衡常数则解离平衡常数:Hb的氧分数饱和度：的氧分数饱和度： 或或两边取负对数：两边取负对数：Hill方程方程对对 作图，作图，Hill作图作图Ø根据方程，根据方程，Hill图应有图应有个个 n 的斜率Ø但测得的斜率反映的不但测得的斜率反映的不是氧结合部位的数目，是氧结合部位的数目， 而是部位之间相互作用而是部位之间相互作用的程度Ø故故Hill图的斜率用图的斜率用nH 表表示，即示，即Hill系数，是协系数，是协同程度的量度同程度的量度四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析Ø若若 n =1，， 配体结合非协同，配体结合非协同， 如肌红蛋白如肌红蛋白Ø若若nH＞＞1，正协同，，正协同， 血红蛋白血红蛋白Ø若若nH = n，即，即nH达到理论极限，达到理论极限， 配体结合完全协同但实测配体结合完全协同但实测 nH 总小于蛋白质中的配体结合总小于蛋白质中的配体结合部位数Ø若若nH＜＜1，负协同，也即一个，负协同，也即一个配体的结合导致后续配体更难配体的结合导致后续配体更难结合，结合， 但例子很少。

但例子很少四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析ØHb 的的 nH＝＝2.8，在，在 nH ＝＝ 1和和 nH ＝＝ 4 两极端之间，表两极端之间，表明明 Hb 和和 O2 的结合是高的结合是高度协同的，但不完全协同，度协同的，但不完全协同， 因因n个个O2在一瞬间结合到在一瞬间结合到同一同一 Hb 分子的概率几乎分子的概率几乎等于零等于零.(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析第一个亚基和第一个亚基和氧结合情况氧结合情况第四个亚基和第四个亚基和氧结合情况氧结合情况ØHb：肺泡中：肺泡中 Y = 0.97，， 肌肉肌肉毛细血管中毛细血管中Y = 0.25释放的氧的氧的 △△Y = 0.72Ø △△Y : 血红蛋白输氧效率的指血红蛋白输氧效率的指标协同性将增加标协同性将增加△△Y值Ø如果是肌红蛋白：从肺泡输如果是肌红蛋白：从肺泡输氧到肌肉，虽然氧到肌肉，虽然p(O2)有相的有相的改变，但改变，但△△Y 不到不到 0.1，表明，表明Mb不适合于担当从肺部到组不适合于担当从肺部到组织转运氧的角色织转运氧的角色.肺泡中的肺泡中的p(O2)约为约为13 kPa；肌肉；肌肉毛细血管中毛细血管中p(O2)约约3 kPa。

Hb适合运输氧的原因：(五) BPG调节Hb对O2的亲和力ØBPG，，Hb 的负异促效应的负异促效应物或称别构抑制剂物或称别构抑制剂ØBPG与与Hb 作用是异促别作用是异促别构调节的实例构调节的实例Ø正常红细胞约含正常红细胞约含 4.5 mmol/L BPG，和，和Hb等摩等摩尔数，尔数，BPG 部位在亚基部位在亚基形成的中央孔穴形成的中央孔穴Ø高负电荷高负电荷BPG把两把两β链交链交联在一起联在一起 Hb 分离提取分离提取后，仍结合相当量的后，仍结合相当量的BPG，很难完全被除去很难完全被除去αα1 1αα2 2ββ1 1ββ2 2Lys β82 （（EF6））His β2（（NA2））His β143 （（H21））Val β1（（NA1））Val β1（（NA1））His β143 （（H21））His β2（（NA2））Lys β82 （（EF6））(五) BPG调节Hb对O2的亲和力ØBPG和和β链之间的离子键链之间的离子键有助于稳定有助于稳定T态的态的Hb构象，构象，促进氧的释放促进氧的释放Ø变为变为R态时，态时，Hb中央孔穴中央孔穴变小变小, 容纳不了容纳不了BPG，， 因因O2的结合引起的结合引起Hb构象变构象变化，扰乱了化，扰乱了BPG的结合部的结合部位。

位 O2和和BPG与与Hb的结的结合互相排斥合互相排斥ØBPG：肌肉组织代谢产生肌肉组织代谢产生αα1 1αα2 2ββ1 1ββ2 2Lys β82 （（EF6））His β2（（NA2））His β143 （（H21））Val β1（（NA1））Val β1（（NA1））His β143 （（H21））His β2（（NA2））Lys β82 （（EF6））Y△Y△Y△Y4.5mmol/L7.5mmol/LØ完全脱完全脱BPG的的 Hb对对O2的亲和力很高，的亲和力很高， 能在能在4kPa p(O2)下为下为O2所饱所饱和，几乎不释放氧，和，几乎不释放氧，氧结合曲线呈双曲线氧结合曲线呈双曲线形式BPG对Hb 样合曲线的影响Y△Y△Y△Y4.5mmol/L7.5mmol/LØ肺部肺部p(O2)大于大于13 kPa，，Hb几乎全被几乎全被O2饱和，饱和，BPG与与氧合关系不大外周组织氧合关系不大外周组织p(O2)低低(<4 kPa)，如无，如无BPG，就会减少，就会减少Hb对组织的氧对组织的氧供应有BPG (4.5mmol/L)的存在，的存在，Hb对对O2的亲和力的亲和力低，氧结合曲线呈现正常低，氧结合曲线呈现正常的的S形曲线，供给组织的氧形曲线，供给组织的氧量量(卸氧量卸氧量)约为血液所能约为血液所能携带的最大氧量的携带的最大氧量的40%(△△Y)。

BPG对Hb 样合曲线的影响Y△Y△Y△Y4.5mmol/L7.5mmol/LØ常人在短时间内由海平常人在短时间内由海平面升到海拔面升到海拔4 500 m高山高山时，红细胞中的时，红细胞中的BPG浓浓度几小时后就开始上升，度几小时后就开始上升，两天内可由两天内可由4.5mmol/L 增到增到 7.5mmol/L. 释氧从释氧从30%提高约提高约40%BPG对Hb 样合曲线的影响ØCO2和和H+组织呼吸产生的两个终产物组织呼吸产生的两个终产物ØCO2水中的溶解度很小，容易形成气泡红细胞含丰富的水中的溶解度很小，容易形成气泡红细胞含丰富的碳酸酐酶，催化碳酸酐酶，催化CO2和水生成和水生成HCO3- 和和 H+Ø呼吸产生的呼吸产生的CO2 约约70%～～80%以以HCO3-的形式转运到肺部的形式转运到肺部. CO2 水合增加了组织中的水合增加了组织中的H+浓度ØCO2也能和也能和 Hb 氨基末端氨基末端 α-NH2共价结合生成氨基甲酸共价结合生成氨基甲酸Hb (Hb-NHCOO-), 约约20% CO2以此形式转运到肺部；同时也以此形式转运到肺部；同时也产生产生H+，进一步降低组织中，进一步降低组织中pH。

ØHb与与O2结合和与结合和与H+(或或CO2)结合是相拮抗的结合是相拮抗的. [H+] ↑将提高将提高O2 释放六) H+和CO2调节Hb对O2的亲和力:Bohr效应(六) H+和CO2调节Hb对O2的亲和力:Bohr效应Bohr 效应：效应：当当H+浓度增加时，浓度增加时，Hb氧分数饱和度曲线右移氧分数饱和度曲线右移pH 对对 Hb 氧亲和力的影响，因丹麦生理学家氧亲和力的影响，因丹麦生理学家Bohr G发现而得名发现而得名pH对对Hb氧分数饱和氧分数饱和度曲线的影响：度曲线的影响：肺中血液肺中血液pH7.6，组，组织中织中pH7.2，， 氧结合氧结合实验常在实验常在pH7.4 下进下进行行Ø血液流经组织时，这里的血液流经组织时，这里的pH较低，较低，[CO2]较高，使组织较高，使组织能比单纯能比单纯p(O2)降低获得更多的氧，而氧的释放又促使降低获得更多的氧，而氧的释放又促使Hb与与H+和和CO2的结合，以补偿由于组织呼吸引起的的结合，以补偿由于组织呼吸引起的pH降低，起着缓冲血液降低，起着缓冲血液pH的作用Ø血液流经肺部时血液流经肺部时, 这里这里p(O2)高，有利于血红蛋白与氧的高，有利于血红蛋白与氧的结合，促进结合，促进H+和和CO2的释放，同时的释放，同时CO2呼出又有利于氧呼出又有利于氧合合Hb的生成。

的生成Bohr 效应的生理意义：(一) 镰状细胞贫血病(二) α-和β-地中海贫血四、血红蛋白分子病①①血红蛋白病血红蛋白病(hemoglobinopathy)，，α或或β链发生了变化，例链发生了变化，例如镰状细胞贫血病等；如镰状细胞贫血病等；②②地中海贫血地中海贫血(thalassemia)，缺少了，缺少了α或或β链，例如链，例如α-和和β-地地中海贫血病中海贫血病Hb分子病可分为两类：分子病可分为两类：(一) 镰状细胞贫血病GluVal非洲的某些地区发病率非常高非洲的某些地区发病率非常高Hb量仅为正常人量仅为正常人(15~16g/100 mL)的一半，红细胞数目也是正常人的一半左右的一半，红细胞数目也是正常人的一半左右.Val侧链：侧链： “粘性粘性” 突起与突起与 Phe β85、、Leu β88形成的互补口袋形成的互补口袋借疏水作用形成纤维状结晶，借疏水作用形成纤维状结晶，使红细胞弯成镰刀状，不易通使红细胞弯成镰刀状，不易通过毛细血管，因而血流变慢，导致组织缺血受伤，影响器官过毛细血管，因而血流变慢，导致组织缺血受伤，影响器官正常功能正常功能镰状细胞贫血病镰状细胞贫血病发病机制：发病机制：1.缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因;2.所有基因都可能存在所有基因都可能存在,但一个或多个基因发生无义突变但一个或多个基因发生无义突变,结果产生缩短了的蛋白链结果产生缩短了的蛋白链,或发生移码突变或发生移码突变,致使合成致使合成的链含不正确的氨基酸序列的链含不正确的氨基酸序列;3.所有基因都可能存在所有基因都可能存在,但突变发生在编码区之外但突变发生在编码区之外,导致导致转录被阻断或前体转录被阻断或前体mRNA的不正确加工。

的不正确加工二) α-和β-地中海贫血产生途径:(二) α-和β-地中海贫血1.β-地中海贫血：地中海贫血：β -珠蛋白基因丢失或不能表达，此缺损珠蛋白基因丢失或不能表达，此缺损的纯合子个体将产生严重的症状患者不能制造的纯合子个体将产生严重的症状患者不能制造β链，必链，必须依赖胎须依赖胎γ链的继续产生以形成有功能的血红蛋白链的继续产生以形成有功能的血红蛋白(Hb F)2.γ链的产生可以继续到童年，但多数不到成熟就夭折了链的产生可以继续到童年，但多数不到成熟就夭折了. 3.杂合子患者症状较轻，这种人有一个杂合子患者症状较轻，这种人有一个β基因仍是正常的，基因仍是正常的，β-地中海贫血性状地中海贫血性状(二) α-和β-地中海贫血1.α-地中海贫血地中海贫血: 在每个染色体上有两个邻接的拷贝在每个染色体上有两个邻接的拷贝(α1和和α2)，它们的蛋白质产物只差一个氨基酸残基，并且都是，它们的蛋白质产物只差一个氨基酸残基，并且都是有功能的，因此一个人可以有有功能的，因此一个人可以有4、、3、、2、、1或或0个个α基因拷基因拷贝2.含含4个拷贝是正常的，仅含个拷贝是正常的，仅含1个拷贝的可能表现出轻微的个拷贝的可能表现出轻微的症状，即症状，即α-地中悔贫血性状。

地中悔贫血性状3. 0个拷贝则是致命性的，称为个拷贝则是致命性的，称为α-地中海贫血地中海贫血α-珠蛋白链珠蛋白链的水平低下时，将形成同四聚体的水平低下时，将形成同四聚体: β4或或γ 4等同四聚体能等同四聚体能结合结合O2，但无协同性或无别构效应，因此不能发挥正常，但无协同性或无别构效应，因此不能发挥正常的功能(一) 免疫系统(自学)(二) 免疫球蛋白的结构和类别(三) 基于抗体一抗原相互作用的生化分析方法五、免疫球蛋白(一) 免疫系统(自学)The table summarizes the functions of the various leukocytes of the immune system体液免疫体液免疫细胞免疫细胞免疫抗原抗原抗体抗体抗原决定簇（表位）抗原决定簇（表位）Molecules of Mr<5,000 are generally not antigenic(二) 免疫球蛋白的结构和类别1.1.免疫球蛋白免疫球蛋白( (抗体抗体),), 可溶性血清糖蛋白，血清中最丰富可溶性血清糖蛋白，血清中最丰富的蛋白质之一的蛋白质之一2.2.抗体具有两个显著的特点：高度的特异性抗体具有两个显著的特点：高度的特异性; ; 庞大的多样庞大的多样性。

性u特异性：一种特定的抗体只能与引起它产生的相应抗特异性：一种特定的抗体只能与引起它产生的相应抗原发生反应原发生反应u多样性：抗体可以和成千上万种抗原多样性：抗体可以和成千上万种抗原( (天然的和人工天然的和人工的的) )起反应　起反应　1.Y形结构；形结构；4条链：二重、二条链：二重、二轻2.抗体分子抗体分子 (IgG) 二价；抗原分二价；抗原分子可以是多价的子可以是多价的3.价数：抗原与抗体结合部位价数：抗原与抗体结合部位数目4.当抗体和抗原接近等物质的当抗体和抗原接近等物质的量量(称为等价带称为等价带)浓度时，将发浓度时，将发生最大的交联，产生最大量生最大的交联，产生最大量的免疫沉淀或沉淀素的免疫沉淀或沉淀素5.体外沉淀反应广泛用于研究体外沉淀反应广泛用于研究抗原抗原-抗体反应，实验免疫学抗体反应，实验免疫学的基础免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的类别按照重链的类型分为按照重链的类型分为: 类别类别 重链重链 轻链轻链 Ig G γ κ或或λ Ig A α κ或或λ Ig M μ κ或或λ Ig D δ κ或或λ Ig E ε κ或或λEach class has a characteristic type of heavy chain, denoted α、δ、ε、γ and μfor IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, respectively；Two types of light chain,κandλ,occur in all classes of immunoglobulins. ØIg G 记忆记忆B细胞引发的再次免疫反应的主要抗体，可以通细胞引发的再次免疫反应的主要抗体，可以通过胎盘。

过胎盘 ØIg A 唾液、泪液、乳汁等分泌物的主要抗体，可单体、唾液、泪液、乳汁等分泌物的主要抗体，可单体、二聚体或三聚体二聚体或三聚体ØIg M 初次免疫反应早期产生的，可以以单体形式与膜结初次免疫反应早期产生的，可以以单体形式与膜结合，或形成合，或形成5聚体ØIg D 主要存在于主要存在于B细胞表面，功能不详细胞表面，功能不详ØIg E 与过敏源结合诱导细胞产生组胺和其他活性胺，使与过敏源结合诱导细胞产生组胺和其他活性胺，使血管扩张，渗透性增大，引起炎症反应血管扩张，渗透性增大，引起炎症反应免疫球蛋白的类别J chainHevay chainLight chainIg M(三) 基于抗体一抗原相互作用的生化分析方法1.Polyclonal antibodies are those produced by many different B lymphocytes responding to one antigen, such as a protein injected into an animal. Cells in the population of B lymphocytes produce antibodies that bind specific, different epitopes within the antigen. Thus, polyclonal preparations contain a mixture of antibodies that recognize different parts of the protein. 2.Monoclonal antibodies, in contrast, are synthesized by a population of identical B cells (a clone) grown in cell culture. These antibodies are homogeneous, all recognizing the same epitope. 单克隆抗体的制备Ø用选定的抗原免疫小鼠，取出脾脏，制备用选定的抗原免疫小鼠，取出脾脏，制备B淋巴细胞。

淋巴细胞Ø培养小鼠的骨髓瘤细胞培养小鼠的骨髓瘤细胞ØB淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合Ø转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基上转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基上,培养选择培养选择杂交瘤细胞杂交瘤细胞Ø用用ELISA筛选产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞筛选产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞Ø用小鼠腹水或培养箱培养选出的杂交瘤细胞用小鼠腹水或培养箱培养选出的杂交瘤细胞Ø纯化所需的单克隆抗体纯化所需的单克隆抗体酶联免疫吸附测定1.Coat surface with sample (antigens). 如如 HIV2.Block unoccupied sites with nonspecific protein. 如酪蛋白或牛血清白蛋白如酪蛋白或牛血清白蛋白3.Incubate with primary antibody against specific antigen. 如抗如抗HIV外壳蛋白的兔外壳蛋白的兔I G4.Incubate with antibody-enzyme complex that binds primary antibody. 如辣根过氧化物酶标羊如辣根过氧化物酶标羊抗兔的抗抗体抗兔的抗抗体,即羊抗兔即羊抗兔IgG或第二抗体或第二抗体5.Add substrate. 如辣根故氧化物酶，加如辣根故氧化物酶，加 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺四甲基联苯胺6.Formation of colored product indicates presence of specific antigen. 如是四甲基联苯胺则产物黄色，如是四甲基联苯胺则产物黄色，450nm有最大光吸收，量与待测抗原或抗体量成有最大光吸收，量与待测抗原或抗体量成正比正比1.也称也称Western印迹，印迹， 操作上类似操作上类似用于核酸分析的用于核酸分析的Southern印迹。

印迹2.对蛋白质样品进行凝胶电泳分离对蛋白质样品进行凝胶电泳分离,然后凝胶板与硝酸纤维膜贴在一然后凝胶板与硝酸纤维膜贴在一起，进行转移起，进行转移,将凝胶上的蛋白条将凝胶上的蛋白条带转印到纤维膜上带转印到纤维膜上3.如如ELISA中所述中所述,将纤维封闭将纤维封闭,然然后相继用第一抗体、酶标第二抗后相继用第一抗体、酶标第二抗体以及底物进行处理体以及底物进行处理4.只有含待测蛋白质的条带显示颜只有含待测蛋白质的条带显示颜色5.免疫印迹能检测样品中的微量成免疫印迹能检测样品中的微量成分和近似相对分子质量分和近似相对分子质量免疫印迹测定 (immunoblot assay)SDS-PAGE凝胶上泳道凝胶上泳道1是标准蛋白质的分是标准蛋白质的分离条带泳道离条带泳道2和和3分别是尿激酶制剂分别是尿激酶制剂(作为作为抗原抗原)纯化前和纯化后样品的条带纯化前和纯化后样品的条带(考马斯亮考马斯亮蓝染色泳道蓝染色泳道4到到6的样品分别与的样品分别与1到到3相同相同, 凝胶电泳后被转印到硝酸纤维膜上并用抗尿凝胶电泳后被转印到硝酸纤维膜上并用抗尿激酶的单克隆抗体激酶的单克隆抗体“探测探测”的的SDS gelImmunoblot六、氨基酸序列与生物功能(一) 同源蛋白质的物种差异与生物进化(二) 同源蛋白质具有共同的进化起源(一) 同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质：同源蛋白质： 不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质，不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质，如血红蛋白；同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的如血红蛋白；同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，称为相似性，称为序列同源性。

序列同源性具有明显序列同源的蛋具有明显序列同源的蛋白质也称同源蛋白质；白质也称同源蛋白质；不变残基；可变残基不变残基；可变残基细胞色素细胞色素C系统[发生]树根据细胞色素根据细胞色素c 绘制绘制(二) 同源蛋白质具有共同的进化起源Inspection of the amino acid sequences of the globin chains of human hemoglobin and myoglobin reveals a strong degree of homology. Theα-globin and β-globin chains share 64 residues of their approximately 140 residues in common.Myoglobin and the α-globin chain have 38 amino acid sequence identities. This homology is further reflected in these proteins’ tertiary structure. (Irving Geis)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶，这些酶的活性中心的特异胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶，这些酶的活性中心的特异性丝氨酸残基起关键作用，称丝氨酸蛋白酶类。

凝血酶和纤溶酶也性丝氨酸残基起关键作用，称丝氨酸蛋白酶类凝血酶和纤溶酶也属于此类这类蛋白质显示明显的序列同源性，但是却有趣异的生属于此类这类蛋白质显示明显的序列同源性，但是却有趣异的生物功能这类蛋白质是经过祖先丝氨酸蛋白酶基因的复制而来物功能这类蛋白质是经过祖先丝氨酸蛋白酶基因的复制而来. .丝氨酸蛋白酶类丝氨酸蛋白酶类: :1.熟悉肌红蛋白的结构与功能 2.掌握血红蛋白的结构与功能 3.熟悉血红蛋白分子病 4.熟悉免疫系统和免疫球蛋白 5.了解蛋白质的结构与功能的进基本要求：作业题：第 3、5 题。