免疫荧光技术操作步骤.docx

免疫荧光技术操作步骤免 疫 荧 光 技 术 操 作 步 骤一.直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使 用标记抗体用量偏大试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L,荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸曰鈴举温不箱等实验步骤1. 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）3. 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖5. 立即用荧光显微镜观察观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（士）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（士）或（-），即可判定为阳性注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1 : 20-100之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱， 影响结果的观察2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够染色温度多采用室温（25C左右），高于37C可加强染色效果， 但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2C的低温，延长染色时间低温染 色过夜较37C30 min效果好的多3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴L，的PBS⑵特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色4. —般标本在高压*灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长， 荧光强度会逐渐下降。

二.间接免疫荧光法测抗原基本原理染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原（待检标本）标本上，在湿盒中37C保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体（通常为荧光标记的对应二抗）如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结 合，从而可鉴定被检测抗原试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+碳酸盐缓冲液1份配制荧光标记的抗人球蛋白抗体：以L，的PBS进行稀释搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸曰鈴举3/ C/^H不箱等实验步骤1. 滴加L，的PBS于未知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度2. 滴加以L，的PBS适当稀释抗体，覆盖未知抗原标本片将玻片置于有盖搪瓷盒内，37C保温30min3. 取出玻片，置于玻片架上，先用L，的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振 荡4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记二抗5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37C保温30min。

6. 重复操作37. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片8. 荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法注意事项1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h，时间过长，会使荧光减弱2. 每次试验时，需设置以下两种对照：（1） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物（需有使用人员自行建立标准）（2） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色3. 未知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥4. 所滴加的抗体或荧光标记物，应始终保持在未知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色Storage: Store at -0 oC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. Thelyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greaterthan a year when kept at -20oC. When reconstituted in sterile pH PBS or diluentof antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 oC.Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use inhuman, therapeutic or diagnostic applications.。