褚泰伟应用化学基础第八章 标记化合物.ppt

第八章 标记化合物1分子中含有一个或多个稳定或者放射性同位素的化合物分子中含有一个或多个稳定或者放射性同位素的化合物分析试剂分析试剂 示踪试剂示踪试剂测定微量物质测定微量物质示踪研究示踪研究用用 途途定定 义义标记化合物标记化合物2本章主要内容•8.1 稳定示踪原子的制备与分离•8.2 放射性核素的生产•8.3 标记化合物的基本概念•8.4 标记化合物的选择•8.5 标记化合物的制备•8.6 标记化合物的纯化和鉴定•8.7 放射性标记化合物的稳定性与贮存38.1 稳定示踪原子的制备与分离•1、、1912年年，，Thomson首首先先发发现现稳稳定定性性核核素素20Ne和和22Ne（氖）•2、、1929年，年，Naude发现了发现了15N•3、、1937年年，，Urey等等首首次次报报道道人人工工生生产产15N的的方法•4、、1940年，获得年，获得15N、、18O和和3H大量生产大量生产45. 1947年年9月在美国月在美国Wisconsin大学召开了大学召开了“同位同位素在生物学和医学中应用素在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开专题讨论会，从此开始了始了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。

稳定性核素示踪技术应用的新纪元6. 近近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方法取得了较大突破，分析方法取得了较大突破，13C、、2H、、18O、、15N广广泛应用于生物学、医学、环保、农药、农学、微泛应用于生物学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域我国先后分离了生物等研究领域我国先后分离了25种元素的种元素的100多种稳定性核素，例如：多种稳定性核素，例如：15N标记化合物就有标记化合物就有30余余 种5几个概念几个概念 稳定性同位素（稳定性同位素（Stable isotope）） 丰度（丰度（Abundance）） A 即某核素在该组同位素中的浓度即某核素在该组同位素中的浓度(通常指人通常指人工加浓了的工加浓了的) 自然丰度（自然丰度（Natural abundance）） A自自(AO) 15N：：0.365%、、18O:0.204% 原子百分超（原子百分超（Atom percent excess）） a a = A-A自自 又称富集度（又称富集度（Enrichment）） 富集富集15N（（Enriched15N）） 贫化贫化15N（（Depeled15N )6 重要化学元素的稳定性同位素重要化学元素的稳定性同位素元素元素 同位素同位素 自然丰度自然丰度 样品来源样品来源H 1H 99.985 新鲜的表面淡水新鲜的表面淡水 2 H(D) 0.0147 B 10B 18.46 意大利天然硼酸盐意大利天然硼酸盐 11B 81.54C 12C 98.892 捷克扑利兹石灰石捷克扑利兹石灰石 13C 1.108 N 14N 99.635 大气中的氮气大气中的氮气 15N 0.365O 16O 99.759 大气中的氧气大气中的氧气 17O 0.0374 18O 0.20397 氮的同位素表氮的同位素表同位素同位素 射线种类射线种类 半衰期半衰期 自然丰度自然丰度12N ββ+ 0.011S13N ββ+ 9.96m14N - - 99.635- - 99.63515N - - 0.365- - 0.36516N ββ- 7.1S17N ββ- 4.15S18N ββ- - 0.63S8同位素效应•1 概念•一种元素的同位素之间，由于质量的不同，会使它们在物理、化学、生物学等性质方面表现出一定的差异，这种现象称为同位素效应。

•是由于质量、核自旋等性质不同引起的•质量差异越大的同位素效应越明显•如1H和2D相差100%；蒸发热相差41.3%；235U和238U相差1.3%，235UF6和238UF6蒸发热的差异用最精密的仪器还不能测定出来9•有些物理性质与其核质量的相对差异没有直接联系，只与分子的结构有关，这时的同位素效应一般极小•例如：25oC时，H2O和D2O的折射率仅仅相差0.37%，而导磁率和偶极距则几乎完全相等10物理的同位素效应•元素的同位素之间在物理性质上存在差异•如扩散速率不同导致的重力分布差异：地球大气高层14N富集，下层15N较多；•油田中较浅的油井的硫32S/34S比值高，说明深层的H232S扩散到上层111213热力学的同位素效应•在热力学平衡条件下，物质之间的稳定同位素的配分关系由同位素交换反应的平衡常数来描述•同位素交换反应：某一元素的不同同位素在分子间彼此交换•HCl + D2O ⇔ DCl + HDO•同位素交换平衡常数：14•当不同同位素在分子内以及分子间的行为都一致时，同位素交换反应的平衡常数为：K∞•实际的同位素交换平衡常数与上述不一致，其偏离的程度（分离系数）就表示了热力学同位素效应的大小：α = K / K∞•注意：在复杂的同位素交换反应中，分离系数不是上述简单的关系。

15例：相平衡中的同位素效应•α = P / P* (蒸气压比蒸气压比)•正的同位素效应：• α>1， 轻的同位素在气相中富集•负的同位素效应：重的同位素在气相中富集•如：某些有机酸的氘化物在气相中缔合比氢化物强，氘酸在气相中富集16动力学同位素效应•同位素的取代使反应物的能态发生变化，可引起化学反应速率产生差异用于：•分离同位素•研究化学反应机理•研究溶液理论17•动力学同位素效应α：•绝对动力学同位素效应•正同位素效应：α>1 或ε> 0•负同位素效应：α<1 或ε< 018稳定同位素分离•稳定同位素的生产实质上是把某元素内的稳定同位素分开, 加以浓集, 故又称分离或富集•稳定同位素分离具有天然丰度低、分离系数小、平衡时间长的特点, 因此富集十分困难为此工艺上采用长分离柱、或称塔、多级级联方式, 操作连续化和自控装置19分离系数•分离系数的定义为: 当二个同位素(A和A’),在二相之间(I和II)处于平衡状态时, 如可逆过程所示•此平衡常数称为分离系数,20分离方法•根据同位素的质量差别和零级能不同的性质, 分离方法有电磁法、离心法、电解法、扩散法、精馏法、化学交换法以及光化学法等。

目前工业规模生产的方法主要是精馏法和化学交换法21精馏法•一般而言, 精馏法通量大, 适合于大规模生产,是目前生产C-13、O-18、N-15等同位素的重要方法•碳同位素分离:分离C-13主要采用CO低温精馏法操作温度在-195℃时, 分离系数α(13C/12C)=1.008-1.01022氧同位素分离•生产O-18的主要方法是水蒸馏法和NO低温精馏法水蒸馏法生产O-18历史悠久, 六十年代前都采用此法虽然分离系数较低(1.0063), 但原料价廉易得, 设备简单, 操作方便, 技术成熟, 所以至今仍采用•目前, 以色列的威尔兹曼研究院建有世界上最大的O-18水蒸馏装置, 该装置共由27根塔组成, 塔高为10-15米, 塔径分别为100-17 毫米生产能力每年O-18为5.5公斤,浓度98.5 O-18原子%; O-17为0.9公斤, 浓度为20 O-17原子%然后, 再采用由104根塔组成的热扩散装置进一步富集, 使O-18浓度提高到99.9 O-18原子%；O-17浓度提高到96 O-17原子%23化学交换法•是目前生产重水、N-15 和S-34等同位素的主要方法•硫化氢—水双温交换法是当今最经济的制取重水的工业方法之一。

•硫化氢—水双温交换法的主要优点是, 原料—水, 实际上不受限制, 水和硫化氢之间同位素交换反应速度快, 作为主要能量消耗的热量的部分回收程度高, 而且可利用冷水来维持冷塔中必要的温度工况, 而热塔的温度工况可用较低参数的载热体来维持•详细参见《低温与特气》1998年3期28-33页24氢、碳、氮、氧、硫稳定同位素的主要生产状况25氢、碳、氮、氧、硫稳定同位素的主要生产状况（续）26天然放射性核素天然放射性核素人工放射性核素人工放射性核素 医用放射性核素主要通过医用放射性核素主要通过人工核反应人工核反应 生产生产反应堆反应堆加速器加速器中子流照射中子流照射核燃料中提取核燃料中提取8.2. 放射性核素的生产27288.2.1. 放射性核素生产的概况•人造卫星、宇宙飞船的小型电器•人体所用的心脏起搏器（核电池）•测试仪器（检测器、烟雾报警器）•农业育种，防治病虫害•医学上诊断、治疗•化学、生物实验的各种示踪29生产核素应重点考虑的问题1.选择适宜的核反应2.选靶与制靶：化学稳定性、辐照稳定性，同位素分离的富集靶3.估计产额和照射时间4.放射化学分离5.产品的鉴定与测量8.2.1.1 靶子的制备一、制备反应堆照射靶或靶容器时应考虑的因素1、中子通量：许多供研究用的反应堆可望提供1012-1013cm-2.s-1中子通量。

这种情况下塑料容器较为理想2、照射时间：如果照射时间不太长（分钟级），用高纯铝箔包装（因为28Al半衰期2.8min，先让其衰变掉)30 照射时间较长时，将样品密封在抽真空的石英瓶内，但必须将照射后的石英瓶冷却一段时间，使高放射性的31Si (T1/2=2.6h)衰变掉还必须考虑到将密封的石英瓶打碎时，对人体不产生过量的照射和严重的污染3、被照射物的热稳定性：在不同类型的核反应中，温度差别较大，一般要用水或液氮冷却，但水的辐射效应较为严重4、自屏蔽效应：0.1mm厚的金可使热中子注量率降低6%31二、靶子类型二、靶子类型1、厚靶 用加速器制备放射性核素，而不需要知道有关反应的定量资料时，一般使用厚靶如：通过(α,n)反应制备放射性核素时，一般用40MeV的4He离子，用厚靶使4He能量先下降到几个MeV而接近(α,n)反应的反应阈能，以获得最大产额 在回旋加速器上使用厚靶时，因为在靶子中能量耗散很大，1平方厘米面积上可达1KW，所以必须考虑冷却问题 在特殊情况下可用液体靶，甚至流动气体靶322、薄靶薄靶的厚度一般为每平方厘米数微克。

1）薄靶的使用范围加速器上一般使用薄靶，具体情况取决于试验目的●测定反应截面：必须薄到使轰击粒子通过它时，不因为粒子能量损失而使截面有显著变化●测定反应所产生的粒子能谱：如果靶子太厚，靶子中的次级粒子的相互作用将影响初级离子相互作用的测定●测定反冲核的动量分布和角分布：只有靶子相当薄，才能使反冲产物在飞离靶子的路程中没有明显的散射和能量损失33（（2）薄靶的制备技术）薄靶的制备技术•真空蒸馏法：真空条件下，将靶子物蒸馏沉积在各种衬底材料上衬底材料可以是金属薄箔、塑料薄膜等•电沉积法：适用于沉积金属、氧化物或其他化合物现代技术中应用最多的是分子电镀，就是从有机溶剂中电沉积各种分子•气体在热表面上的热分解：如B2H6制备硼膜，Ni(CO)4制镍膜，CH3I制备碳膜等•悬浊液沉淀法：用于对靶子的均匀性要求不严格的条件下常常外加某些粘合剂34（（3）薄靶厚度的测定）薄靶厚度的测定•称重法：制靶前，先称量衬底材料的重量，然后再称制靶后的重量，通过计算求得靶子的厚度在靶子和衬底材料重量比较大时，这种结果比较准确，但此法不能确定靶子的均匀度•射线吸收法：将待测薄膜插在放射源和探测器之间，测量其α、β粒子能量或数量来确定靶子的厚度。

358.2.1.2 靶子化学靶子化学 对照射后的靶子需要处理，以确定核反应中反应物的产额、产物中已知或未知核素的鉴定其方法就是用化学方法将靶子进行化学分离和提纯一、分离和提纯核反应产物的原则1、快速：特别是对于半衰期很短的核素的分离和纯化时，要在尽可能短时间内完成2、抓重点：重点先分离一种或几种核素核反应产物中有许多是相邻元素，一些高能核反应与核裂变反应的产物中原子序数分布范围相当宽，产物数量多，因此分离流程相当复杂，一般是先将一个或几个元素与其它元素进行分离363、不求回收率 不一定要求回收率很高，高化学纯度也不重要，只要求得到产物，以满足后续实验即可4、安全防护：操作时要注意放射性物质对人体的伤害操作高放物质时，注意屏蔽，或增加操作距离5、辐射化学效应：某些情况下，辐射化学效应将影响分离流程376、使用载体和反载体： 核反应中所产生的放射性物质的量都是很少的，通常的分离方法（沉淀、过滤、离心等）都不适用为了达到分离目的，一般都要使用载体载体分同位素载体和非同位素载体对非同位素载体有一定的要求，载体的用量一般在0.1-10mg之间，通常根据对产物的比活度的预期值来确定。

38二、核反应产物常见的分离方法二、核反应产物常见的分离方法1、沉淀法•结晶共沉淀：要生成同晶必须是：化学类似物，有相似的化学结构，相近的化学构型其中又分为均匀分配和非均匀分配•吸附共沉淀：放射性核素吸附于表面发达的沉淀物表面一起沉淀392、离子交换法3、色层法 纸上色层、薄层色层、电色层、萃取色层、反相色层等4、溶剂萃取 最典型的溶剂萃取流程是PUREX流程，从辐照核燃料元件中回收铀和钚405、挥发法：用蒸汽压的差来分离放射性物质 6、电化学方法：（1）电沉积法A、根据不同沉积电势分离：微量放射性核素各有不同的临界沉积电势，因此当电极电势等于或大于某一核素离子的临界沉积电势时，此种离子就会在阴极出现沉积B、分子电镀：在非水溶液中高电压下电解，成为分子电镀 此方法多用于制备α放射性核素的薄源41（2）汞阴极电解法：用于分离沉积电势比H+负的金属离子因为H2在Pb和Pt上析出时有更大的超电势，又因汞能与许多金属生成汞齐，所以许多活泼金属也能从水溶液中沉积在汞阴极上3）电化学置换法：电极电势低的金属可以从溶液中将电极电势高的金属离子置换出来，使之与溶液分离4）区域电泳法：利用各种离子的离子势（电荷半径比）不同，在电场中的迁移速度不同，在一定电场梯度作用下，经相同的电泳时间后，离子移动距离不同而分离。

42438.2.2. 反应堆生产放射性核素•反应堆提供高注量率的中子流(热中子)•核反应: (n, γ), (n, p), (n, α), (n, 2n), (n, f)•热中子(n, γ)反应截面比较高, 是主要生产方式.•可以生产P-32, Br-82, Au-198, Co-60, Ni-63, Cu-64, Zn-65, Mo-99, Cs-134, La-140, Sm-153, W-185, Tl-204等等•反应堆生产的特点反应堆生产的特点：放射性核素品种多、：放射性核素品种多、活度大、成本低活度大、成本低44原子反应堆反应堆中子流生产的放射性核素反应堆中子流生产的放射性核素中子反应主要有四种：中子反应主要有四种：( (n,α),α),（（n,p),(n,n,p),(n,γ) ), (n,f)(n,f)4546478.2.3. 加速器生产放射性核素•用加速器生产反应堆所做不到的短寿命、缺中子的医用核素•重点是中小型回旋加速器•F-18：O-16(α, d)F-18•I-123: Sb-121(α, 2n)I-123•Co-57: Fe-56(d, n)Co-5748回旋加速器 ( Cyclotron )加速器生产的放射性核素加速器生产的放射性核素将带电粒子有质子（将带电粒子有质子（P），氘核（），氘核（d），氦核（），氦核（αα）加速）加速到一定能量，轰击靶核。

引发到一定能量，轰击靶核引发（（p，，n），）， （（d，，n），），（（d，，αα），）， （（αα，，n），）， （（αα，，pn））等核反应而生产多等核反应而生产多种放射性核素种放射性核素4912C（（d，，n））13N20Ne（（d，，αα））18F16O（（αα，，pn））15O11B（（p，，n））11C 68Zn（（p，，2n））67Ga5051加速器核素的特点：加速器核素的特点：1. 缺中子核素，大多以缺中子核素，大多以EC，，β+方式衰变方式衰变2. 短半衰期生理元素短半衰期生理元素 11C, 13N, 15O 3. 放射性核素比活度较高放射性核素比活度较高4. 价格比较贵价格比较贵528.2.3. 从核燃料后处理厂回收放射性核素•核燃料裂变后产生几百种核素，其中大多数是产额很低、半衰期较短的核素有实际提取意义的仅有十几种•Am-241，热源、α和x射线源•Sr-90，热源•Cs-137，辐射源•Mo-99，医用发生器5354发生器 (母牛)一一. 标记位置及命名标记位置及命名1.同位素标记和非同位素标记 同位素标记：化合物中的原子被其同位素(放射性同位素或稳定同位素)的示踪原子所取代的标记。

取代后化合物（即所得标记化合物）的物理、化学性质(包括旋光性等)，可与原化合物基本相同，也称为理想标记 非同位素标记：标记化合物中的放射性核素不是原化合物中固有元素的同位素如蛋白质用131I或125I标记．所得标记物与原来化合物不完全相同，在体内的生理、生化反应也可能不同，非同位素标记物，只有严格控制标记方法，使其生物学行为改变不大时，才可用作某特定物质的示踪剂8.3 标记化合物的基本概念标记化合物的基本概念55氟尿嘧啶氟尿嘧啶14CH3OH56•2、标记位置及命名标记位置及命名 •命名命名：标记化合物的命名，通常先指出标记部标记化合物的命名，通常先指出标记部位，再指出标记核素，最后列出化合物名称，位，再指出标记核素，最后列出化合物名称，三部分中以二个短横相联接，如三部分中以二个短横相联接，如1 1－－1414C C－醋酸－醋酸．•标记位置标记位置 ：由于使用放射性标记化合物的目的由于使用放射性标记化合物的目的不同，对放射性原子在该化合物中的标记位置不同，对放射性原子在该化合物中的标记位置也有不同的要求，应正确选用并采用合适的制也有不同的要求，应正确选用并采用合适的制备方法备方法。

57定位标记•定位标记定位标记(Specfic labeling)(Specfic labeling)：在研究某些代谢物：在研究某些代谢物质的转化途径或反应机制一类问题时，需要追踪分质的转化途径或反应机制一类问题时，需要追踪分子中某个基团或某个位置上原子的去向，应将子中某个基团或某个位置上原子的去向，应将9595％％以上的放射性原子特定地标记在该基团或该位置上以上的放射性原子特定地标记在该基团或该位置上如如1 1－－1414C C－醋酸、或－醋酸、或2 2－－1414C C－醋酸，前者表示－醋酸，前者表示1414C C标标记在醋酸的羧基碳上，记在醋酸的羧基碳上，CHCH3 31414COOHCOOH，而后者则标记在，而后者则标记在甲基碳上，甲基碳上，1414CHCH3 3COOHCOOH．二者所能示踪的基团不同，．二者所能示踪的基团不同，制备二者的合成路线也完全不同制备二者的合成路线也完全不同 58CH3CH14COOHNH21－－14C－丙氨酸－丙氨酸非定位标记•非定位标记(Non—specific labeling)：又可分为均匀标记(Uniform labeling)和全标记(General labeling)，标记分子中标记的原子没有特定的位置。

•非定位标记化合物不能用于观察分子上特定基团或原子的去向，而只是代表整个分子的代谢、分布等状况非定位标记可以得到较高的比活度．因为在一个分子中，可能存在几个标记原子，且制备方法的选用面也较宽．59非定位标记•均匀均匀标记是指放射性原子均匀地标记是指放射性原子均匀地分布于分子分布于分子中，如中，如用用1414C0C02 2通过植物光合作用制得的通过植物光合作用制得的1414C C－葡萄糖，其分－葡萄糖，其分子中六个碳原子从统计学上看，被均匀地标记上子中六个碳原子从统计学上看，被均匀地标记上1414C C，故可写成，故可写成1414C C－萄萄糖－萄萄糖(u)(u)，或，或u-u-1414C C－葡萄糖－葡萄糖．•全标记则既非均匀标记，又非定位标记，如用同位全标记则既非均匀标记，又非定位标记，如用同位素交换法制备氚标记化合物，往往标记物分子中所素交换法制备氚标记化合物，往往标记物分子中所有氢原子都可被取代，但几率各不相同，则用符号有氢原子都可被取代，但几率各不相同，则用符号G G来表示，如来表示，如G G－－3 3H H－胆固醇－胆固醇( (或或3 3H H－胆固醇－胆固醇(G)(G)）．）．60U-14C-葡萄糖葡萄糖C 标记概率相同标记概率相同G-3H-胆固醇胆固醇H 标记概率不同标记概率不同COOHNH2COOHNH23HCOOHNH23H3HCOOHNH23HCOOHNH2+11.4%27.4%11.4%49.8%产物是全标记产物是全标记, 非定位标记非定位标记 邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸3H261•双标记及多双标记及多标记：标记：是指在化合物分子的不同是指在化合物分子的不同部位，引入一种或二种以上元素的同位素原部位，引入一种或二种以上元素的同位素原子或引入一种元素的两种或两种以上同位素子或引入一种元素的两种或两种以上同位素原子。

原子•它们在示踪应用时，可在同一机体或离体组它们在示踪应用时，可在同一机体或离体组织中同时观察两个指标，不仅减少工作量，织中同时观察两个指标，不仅减少工作量，还可排除和减少还可排除和减少由于个体差异由于个体差异所引起的实验所引起的实验误差．在研究化合物的不同代谢物在代谢中误差．在研究化合物的不同代谢物在代谢中的相互关系、动力学过程以及生物反应机制的相互关系、动力学过程以及生物反应机制等问题中，双等问题中，双( (多）标记示踪剂能解决一般多）标记示踪剂能解决一般示踪实验不易解决的问题示踪实验不易解决的问题 62双标记和多标记双标记和多标记CH335SCH2CH2CH14COOHNH235S －－ 1－－14C－蛋氨酸－蛋氨酸14CH3－－C－－14CH3O1,3 －－14C －丙酮－丙酮63二二. 比活度比活度每毫摩尔分子所含放射性活度每毫摩尔分子所含放射性活度MBq或或GBq (mCi或或Ci) / mmolMBq或或GBq (mCi或或Ci) / mg＊＊ 比活度理论值比活度理论值与与 T1/2 的关系：的关系：T1/2 ↓ 比活度比活度↑（每一个分子接一个放射性原子）（每一个分子接一个放射性原子）64高比活度高比活度示踪研究示踪研究有利于尽量接近生理状态有利于尽量接近生理状态GBq ~ MBq分析系统分析系统灵敏度灵敏度↑＊＊ 根据实验需要，确定适当的比活度根据实验需要，确定适当的比活度658.4 标记化合物的选择 1、示踪原子应该标记在化合物分子的稳定位置上，不至于在示踪过程中发生脱落或者因为同位素交换等因素而失去标记。

一般来讲，极性基团（如-COOH、-OH、-NH2、=NH等）中的氢原子，位于羰基α位置的氢原子，苯环上和羟基处于邻位或对位的氢原子都不稳定 此外，连接在碳上的氧，较为活泼，易与水中的氧相互交换而失去标记66 2、示踪原子应该标记在化合物的合适位置上例如研究氨基酸的脱羧反应，标记必须在羧基的位置上，否则就不可能观察到氨基酸脱羧而生成CO2的生化过程 即使是同一化合物，但因需要标记的位置不同，而使制备化合物的难易程度有很大的差别合成途径的长短、难易程度的不同，使标记化合物的产率和纯度会有很大的差别6768乙酸-1-14C的合成仅需一步格氏反应，就可以完成：乙酸-2-14C的合成却需四步反应，才能得到标记产品：69 为了揭示分子中不同基团所起的作用和特性，常选用多标记化合物进行示踪例如，为了证实体内胆固醇是由简单的乙酸所合成的，并确定乙酸的每个碳原子在胆固醇生物合成中的作用，则需要采用14CH313COOH或者13CH314COOH双标记化合物 实验结果表明，乙酸中的两个碳原子都参与了胆固醇的生物合成，并进入分子结构中。

还表明，胆固醇分子的环状结构中，由乙酸中甲基与羧基所提供碳原子的比值为10：9，而在侧链部分，两者的比值为5：370*者为乙酸中的甲基碳经过双标记乙酸合成的胆固醇分子 3、选择合适的示踪原子进行标记 稳定标记化合物的优点是无辐射损伤，制备和示踪时不受时间因素的限制，也不存在标记化合物的辐射自分解等弊病但稳定同位素标记化合物价格昂贵，观测所需的设备和它的灵敏度不如放射性标记化合物那样迅速，简便和灵敏特别是自然界中如P、Na、I、Co、Au等15种元素，只有一种稳定核素，只能用放射性核素来示踪71 4、选择放射性标记化合物时需要考虑到放射性核素来源的难易、释放出射线的类型和能量、半衰期的长短以及它的毒性和可能引起的辐射损伤还应该注意到标记化合物自身的稳定性及示踪时同位素效应的影响72举例：标记化合物的同位素效应举例：标记化合物的同位素效应 在用较轻的核（如14C和3H）作为标记时，不能忽略同位素效应引起的标记化合物与原化合物之间的性质差异如：正常的C-C键能为82.6 Kcal/mol，而14C-C键能要高出6-10%3H与O、N、C形成的化学键比正常H所形成的键要稳定的多。

73放射性核素的选择前提：不改变原有机化合物的理化性质前提：不改变原有机化合物的理化性质1、放射性核素和化合物的结合要紧密，稳定、放射性核素和化合物的结合要紧密，稳定性要好2、要有合适的半衰期要有合适的半衰期3、射线容易测量，、射线容易测量，γ射线要优于射线要优于β射线4、其它：、其它：748.5 标记化合物的制备标记化合物的制备特点：特点：简单的原料化合物简单的原料化合物 3H2、、14CO2、、Na125I放射性核素价格昂贵放射性核素价格昂贵微量技术微量技术实验操作简单、时间短、最后引人标记原子，实验操作简单、时间短、最后引人标记原子， 冷实验冷实验辐射防护的安全措施辐射防护的安全措施75同位素交换法同位素交换法化学合成法化学合成法生物合成法生物合成法其他：热原子反冲标记法、加速其他：热原子反冲标记法、加速离子标记法离子标记法76一．同位素交换法一．同位素交换法 AX ＋＋ BX★★ AX ★★ ＋＋ BXk1k2原理：原理： 放射性核素与要标记的化合物中放射性核素与要标记的化合物中 同一元素的稳定同位素相互交换同一元素的稳定同位素相互交换 来制备放射性标记化合物。

来制备放射性标记化合物 77交换半值期（交换半值期（Exchange Half－－time）） 产物的浓度等于交换反应达平衡时产物浓度产物的浓度等于交换反应达平衡时产物浓度1 / 2 所需要的时间所需要的时间(1-X/X∞∞) )20℃ ℃ T1/ 2= 5.6 h60℃ ℃ T1/ 2= 2.8 h1.00.50.30.20 5 10 15 20(t)交换半值期交换半值期作为选择最适反应条件的指标作为选择最适反应条件的指标78同位素交换法特点同位素交换法特点:1. 方法简便方法简便, 快速快速, 不需制备标记前体，适宜于稀有、不需制备标记前体，适宜于稀有、结构复杂的有机化合物的标记结构复杂的有机化合物的标记 2. 单键、分子边缘的原子易被交换标记单键、分子边缘的原子易被交换标记中心原子中心原子 不能用此法标记不能用此法标记, 如如14C无法进行定位标记，且有无法进行定位标记，且有机化合物主链上的原子无法标记，标记物的比放射性机化合物主链上的原子无法标记，标记物的比放射性标记低。

标记低 H－－ C－－C －－HHHHHC－－HC－－IC－－SH+3H131I35SC－－3HC－－131IC－－35SH（（×））79（一）、同位素交换反应的实例1、铅在氯化物和硝酸盐之间的交换 212Pb(NO3)2 + PbCl2 = Pb(NO3)2 + 212PbCl2 2、铁在FeCl2和FeCl3之间的交换 59FeCl2 + FeCl3 = FeCl2 + 59FeCl3 3、在乙醇溶液中，碘代烷和碘化钾之间的交换 RI + KI* = RI* + KI4、碘化钾和碘蒸汽的同位素交换 KI + 131II = K131I + I2 80 5、液体汞及其蒸汽的同位素交换 203Hg(液)+Hg(汽)=Hg(液)+203Hg(汽)6、C或N在KCN和HCN之间的同位素交换 a、KCN + H14CN = K14CN + HCN b、KCN + HC15N = KC15N + HCN 7、SO2和SO3之间的同位素交换 32SO2 + SO3 = SO2 + 32SO38、二溴甲苯溶液中邻位和对位溴原子之间的同位素交换9、碳在甲基环己烷中的同位素交换其中：1、2、3、6、7为均相同位素交换；4、5为异相同位素交换； 8、9为分子内同位素交换。

81（二）、同位素交换的定义 不引起体系发生任何物理或化学变化，只是同一元素的相同原子或同位素原子在分子内部、不同分子之间或不同相之间的重新分配过程 （三）、简单同位素交换与复杂同位素交换 简单同位素交换：凡参加交换的两种物质，他们分子中各包含有参加交换的元素，而且每个分子中只有一个原子参加交换，这种反应叫做简单同位素交换反应如果某一分子中同时具有同位素的若干个原子参加交换，但他们在分子中所处的位置相同，则这种交换也称简单同位素交换82举例如下： CCl4+4K*Cl=C*Cl4 +4KCl通式： mAXn + nB*Xm = mA*Xn+nBXm复杂同位素交换复杂同位素交换：凡参加同位素交换的分子中含有若干个同一元素而处于不同位置或具有不同价态的不等同原子之间的交换例：溴与二溴硝基苯之间进行的同位素交换反应由两种以上物质参加的同位素交换反应也属复杂同位素交换，如： CH3I CH3*I + 2Na*I = + 2NaI CH3CH2I CH3CH2*I 83（四）同位素交换反应的机理（四）同位素交换反应的机理1、解离机理2、缔合机理3、电子转移机理4、化学反应机理84A、解离机理 两种化合物均能进行可逆的解离，生成不同同位素的同种粒子（离子、原子或自由基），它们之间将进行同位素交换。

AX = A + X + + BX*= X* + B AX* + BX AX + BX* = A + X + B + X* = AX* + BX85B、缔合机理这种机理基于两种中间过程的结合： a、缔合配合物的形成 b、缔合配合物的分解 AX + BX* = [AXBX*] = AX* + BX例如： HBr + BrBr* =[HBrBrBr*]=HBr*+ Br286C、化学反应机理 进行同位素交换反应的两种分子发生可逆化学反应而引起同位素交换例如：1、*NO2+N2O5=*NO2+NO2+NO3=NO2+*N2O52、*SO2+SO3=*SO2+SO2+1/2O2=*SO3+SO287D、电子转移机理 同一元素不同价态的原子之间，可通过电子转移过程发生同位素交换这种过程中并不发生原子的转移例如： Fe2+ + *Fe3+ = Fe3+ + *Fe2+ 235UO2+2 + 238U(IV) = 238UO2+2 + 235U(IV)88（五）理想同位素交换反应（五）理想同位素交换反应A、理想同位素交换反应的定义1、同位素效应同位素效应：一对同位素置换分子具有的热力学和动力学性质上的差别称之为同位素效应。

一对同位素质量越接近，质量越大，同位素效应越小2、理想同位素交换反应理想同位素交换反应：参加同位素交换反应的所有同位素的化学性质和物理性质完全相同时（即可不考虑同位素效应）的同位素交换反应称之理想同位素交换反应89B、理想同位素交换反应的特点、理想同位素交换反应的特点1、同位素交换反应的平衡常数Kp=1，正逆反应的速度常数相等 k正=k逆2、同位素交换反应无热效应，QT=0，这是因为同位素有完全相同的化学性质即反应既不放热也不吸热3、同位素交换反应中，正逆反应的活化能相等这是因为 QT= E正-E逆=0 所以 E正=E逆4、同位素交换反应的平衡常数与温度无关，即既不吸热，也不放热 dlnKc/dT =△H/RT2 =05、同位素交换反应的进行不伴随化学浓度变化（不是指同位素组成变化）90C、同位素交换反应的推动力、同位素交换反应的推动力 理想同位素交换反应中，所研究的元素全部同位素在化学方面是完全相同的那么，他的热力学基础是什么？ 任何体系都是向着自由能减少的方向进行 △G= △H -T△S △H=0 则 △G=-T△S 对理想同位素交换反应，内能与同位素在各分子间、分子内部各原子（或原子团）之间或各相间的分配无关，因此，同位素交换反应的热力学原因，不是体系消耗内能或热焓使功焓或自由能减少，而是依靠熵的增加。

91二．化学合成法二．化学合成法: 通过各种化学反应，将放射性核素引入通过各种化学反应，将放射性核素引入到待标记化合物特定位置上的标记方法到待标记化合物特定位置上的标记方法合成特点合成特点 (1) 只能选用简单的放射性原料只能选用简单的放射性原料,如如:(2) 需要微量合成装置及分离纯化技术需要微量合成装置及分离纯化技术 mg级级(3) 预先进行冷试验预先进行冷试验优点：优点：定位标记定位标记、产品纯度高、比活度高、、产品纯度高、比活度高、分离提纯容易分离提纯容易缺点：步骤多、流程长、费时费力缺点：步骤多、流程长、费时费力Ba14CO3 、、3H2、、Na125I、、H235SO4等等92三．生物合成法三．生物合成法 利用动物、植物、微生物的生理代谢过程或酶的利用动物、植物、微生物的生理代谢过程或酶的生理活性，将简单的放射性物质制备成具有生物活性生理活性，将简单的放射性物质制备成具有生物活性的放射性标记化合物如放射性标记的激素、蛋白质、的放射性标记化合物如放射性标记的激素、蛋白质、核苷酸、抗生素、糖类等核苷酸、抗生素、糖类等14C – AcOEt 肝组织肝组织 14C – 胆固醇胆固醇 Na125I 甲状腺甲状腺 125I - 甲状腺素甲状腺素14CO2 小球藻小球藻 14C–L–氨基酸氨基酸 14CO2 叶子叶子 14C–D–糖类糖类（乙酸乙酯）93OHOOHOHOOHNNC3H3OOHNNC3H3OHOHO+脱氧核糖脱氧核糖转移酶转移酶3H-甲基胸腺嘧碇甲基胸腺嘧碇脱氧核糖脱氧核糖3H-甲基胸腺嘧碇核苷甲基胸腺嘧碇核苷生物合成法缺点：生物合成法缺点： 产量和比活度较低、标记位置不确定。

产量和比活度较低、标记位置不确定优点是可以合成一些化学合成法无法合成的化合物优点是可以合成一些化学合成法无法合成的化合物94•四、络合物四、络合物/ /螯合物生成法：螯合物生成法：•将放射性金属离子与特点的化合物进行络将放射性金属离子与特点的化合物进行络合和螯合反应，标记到化合物分子上的方合和螯合反应，标记到化合物分子上的方法•操作简单、快速操作简单、快速•但对标记化合物的活性影响较大但对标记化合物的活性影响较大95一．一．1414C 标记化合物制备：标记化合物制备：同位素交换法、化学合成法、生物合成法同位素交换法、化学合成法、生物合成法(2) 制备：制备：(1) 核素特点：核素特点：＊＊96 几种常用核素的标记化合物制备几种常用核素的标记化合物制备1、14C标记化合物的化学合成 反应堆提供的Ba14CO3为初始原料，转化为14CO2、K14CN、Ba14C2和BaN14CN（氨基氰化钡），再经过化学方法合成14C的各类标记化合物97①以14CO2为原料的合成途径•氢化铝锂：414CO2+3LiAlH4=LiAl(O14CH3)4+2LiAl2 LiAl(O14CH3)4+4ROH=LiAl(OR)4+414CH3OH再由14CH3OH可制得其衍生物：如：H14CHO, 14CH3Br,14CH3I,14CH3CH2COOH等。

•格氏试剂 14CO2+RMgBr = R14COOMgBr 水解 R14COOH 常用于制备脂肪酸、甘油酯、氨基酸、激素及生物碱类标价化合物98②以K14CN为原料的合成途径 K14CN与有机卤化物发生取代反应，或与醛分子中的羰基发生加成反应，得到含14C的中间化合物，再经水解、胺解或还原反应可制得14C标记的羧酸、胺类化合物、氨基酸、嘌呤及嘧啶类的标记化合物其中以K14CN合成标记糖类化合物尤为重要99③以BaN14CN为原料的合成途径Ba14CO3+NaN3 NH3 BaN14CN 以BaN14CN为原料可以合成尿素和硫脲，再以尿素和硫脲为原料，可合成嘧啶、嘌呤及其衍生物等杂环分子的标记化合物④以Ba14C2为原料的合成途径 Ba14CO3被金属镁和钡还原可得Ba14C2，水解得乙炔，再进行加氢，加卤素，环化反应等可制得一系列14C标记化合物100 Ba1414CO3 BaN1414CN 1414CH3OH 1414CO2 Ba1414C2 K1414CN 1414CH3I R1414COOH 1414CH≡CH H1414COOH （氰氨基钡）（氰氨基钡）化学合成法：化学合成法：1011．． RMgBr R1414COOH 14CO2(或或ArMgBr) (或或Ar1414COOH)H+3. CH3CHO CH3CH14CN CH3CH14COOHK14CNH2ONH2NH214C-丙氨酸丙氨酸Li14CH314CH32.OO14C-维生素维生素K314CH3ICrO2102二．氚二．氚( (3 3H)H)标记化合物制备标记化合物制备T1/2 ＝＝12.35年年β- Emax＝＝18.4 keV低毒性低毒性人工放射性核素中能量最低人工放射性核素中能量最低C－－3H 不如不如 C－－C 牢固牢固 ，易脱落，易脱落标记化合物不稳定标记化合物不稳定(1) 核素特点：核素特点：同位素交换法、化学合成法、生物合成法同位素交换法、化学合成法、生物合成法(2) 制备：制备：1031.1.氚气曝射交换法氚气曝射交换法（一）（一）同位素交换法同位素交换法3H2全标记全标记比活度不高、放化杂质多比活度不高、放化杂质多104将欲标记的有机化合物分散在玻璃容器壁或玻璃纤维上, 抽真空后充入居里级氚气, 密封, 室温放置几天至数周, 利用氚核衰变发射的射线激发有机化合物分子, 进而发生氚氢同位素交换。

粗产品经分离纯化后, 得到放化纯的氚标记化合物气体曝射法的主要缺点是耗时长、标记率低、粗产品杂质多, 难以分离纯化, 而且产品比放射性活度低, 使该法的应用受到限制105 为了缩短标记时问, 提高标记率, 可以在原来方法的基础上加以改进 通常是用外加能源, 如高压放电, 高频、微波处理, 紫外照射或射线辐照等, 使分子活化, 促进氚氢交换的进行 这些改进方法收到了良好的效果, 大大缩短了标记时间( 从几天缩短至几分钟) , 大幅度地提高了产品的比放射性活度( 从每毫克分子几十毫居提高到几百毫居,甚至达居里级) 2.2.溶液中催化交换溶液中催化交换氚化原料氚化原料: 3H2 、、 3H2O 、、 3H-乙酸乙酸催化剂催化剂: H2SO4 、、 三氯乙酸三氯乙酸 、、 BF3 、、 三乙氨、三乙氨、 (Ph3P)3RhCl 、、Pt 、、 Ni 等等.－－COOH －－OH －－NH －－SH 活性氚活性氚 含有活性氢的溶剂含有活性氢的溶剂溶剂：溶剂： 一般使用不含有活性氢的溶剂一般使用不含有活性氢的溶剂 CH3CN OOO二氧六环二氧六环呋喃呋喃乙腈乙腈106COOHNH2COOHNH23HCOOHNH23H3HCOOHNH23HCOOHNH2+11.4%27.4%11.4%49.8%产物是全标记产物是全标记, 非定位标记非定位标记 邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸3H2107(二二)化学合成法化学合成法是获得是获得定位标记定位标记化合物最为准确可靠的方法化合物最为准确可靠的方法不饱和化合物催化加氚不饱和化合物催化加氚卤化物的催化卤氚置换卤化物的催化卤氚置换金属氚化物的还原反应金属氚化物的还原反应1081.1.不饱和化合物催化加氚不饱和化合物催化加氚RCH＝＝CH2 RCTH－－CTH2RC≡CH RCT＝＝CTHRC≡CH RCT2－－CT2HRC≡N RCT2－－NH2RR’C＝＝O RR’CT－－OHT2Tritium109HOOON－－CH3C－－OHCH3C3H7HOOON－－CH3C－－OHCH3C3H7HgO3H2Pt / CHOOON－－CH3C－－OHCH3C3H73H3H15，，16－－3H－二氢乙托芬－二氢乙托芬1112.2.卤化物的催化卤氚置换卤化物的催化卤氚置换RX (ArX) + 3H2 R3H (Ar3H) + 3HX催化剂催化剂CH2CHCOOHNH2CH2CHCOOHNH22.Br2CH2CHCOOHNH2BrBr3H23H3H苯丙氨酸苯丙氨酸3H-苯丙氨酸苯丙氨酸NH2BrNNONH23HNNO5-3H-胞嘧啶胞嘧啶1.3H2Pd / CaCO3OH-TOH+X-1123.3.金属氚化物的还原反应金属氚化物的还原反应RCOOH(R) RCH3H－－OHRCHO RCH3H－－OHRR’C＝＝O RR’C3H－－OHRC≡N RCH23H－－NH2LiAlH33HNaBH4 NaBH33HLiBH4 LiBH33HLiAlH4 LiAlH33H3H2(硼氚化钠硼氚化钠)(氚化铝锂氚化铝锂)113HOHOC－－CH2NHROHOHOC－－CH2NHROH3HNaBH33H3H－肾上腺素－肾上腺素( R=CH3 )3H－去甲肾上腺素－去甲肾上腺素( R=H )严格的定位标记严格的定位标记只还原杂原子的双键只还原杂原子的双键不还原不还原C＝＝C C≡C ＊＊114（三）生物化学方法•生化合成法的基本原理是利用生物体的代谢过程或某些活性物质如酶的催化将氚化的基质转化成所需要的氚标记物质。

•酶合成法可以在体外进行, 如用从鼠肝中分离出来的脱氧核糖核酸转移酶液可使氚标记的胸腺嘧啶转化成氚标记的胸腺嘧啶核苷115（四）反冲标记法•即利用核反应6Li（n，）3H或者3He（n，p）3H所产生的带有动能的氚原子与有机分子的作用来制备氚标记化合物•如将氨基酸与碳酸锂混合好, 封入真空石英安培瓶或铝容器中, 置于反应堆内, 边冷却边照射一定时间后, 放置几星期, 然后开封就可从被照射的混合物中分离出氚标记的氨基酸由于用核反冲所得的产品中杂质多, 比度低, 因此实用价值不大116三．放射性碘标记化合物的制备三．放射性碘标记化合物的制备√√√＊＊117125I T1/2＝＝60d标记物储存应用一段时间、商品化标记物储存应用一段时间、商品化低能低能 γ 射线射线 ，无，无 β 粒子粒子辐射分解少，标记物稳定性好辐射分解少，标记物稳定性好＊＊118•放射性碘标记化合物原理：放射性碘标记化合物原理： 放射性碘标记蛋白质或多肽的基本原理放射性碘标记蛋白质或多肽的基本原理是将离子碘氧化成单质碘，单质碘的性质是将离子碘氧化成单质碘，单质碘的性质很活波，可以与蛋白质或多肽分子中的酪很活波，可以与蛋白质或多肽分子中的酪氨酸、组氨酸或色氨酸残基上的苯环或咪氨酸、组氨酸或色氨酸残基上的苯环或咪唑环反应，取代上面的氢，形成放射性碘唑环反应，取代上面的氢，形成放射性碘标记化合物。

标记化合物 119标记方法•直接法：直接用氧化剂将直接法：直接用氧化剂将I I- -氧化成氧化成I I+ +的活性的活性形式，再标记到蛋白质分子的酪氨酸残基形式，再标记到蛋白质分子的酪氨酸残基的苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸的苯环上，形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸 •间接法：将碘离子先结合到小分子载体上，间接法：将碘离子先结合到小分子载体上，再将载体与蛋白质结合的方法再将载体与蛋白质结合的方法 120CONHCH2COOHICONHCH2COOH131I+Na131IKIOKIO3 3H+131I－邻碘马尿酸－邻碘马尿酸(一一)同位素交换法同位素交换法:HOIHO131I Na131I150℃ 1h131I－－6 －胆固醇－胆固醇121(二二) 蛋白质、多肽的碘标记技术蛋白质、多肽的碘标记技术:Na125IHOCH2CHCOOHCH2CHCOOHHO125I+125I2NH2NH2125I－碘代酪氨酸－碘代酪氨酸氧化剂氧化剂 ICl，，Ch-T，，H2O2标记原理：标记原理：122NHN125ICH2CHCOOHNH2125I－碘代－碘代组氨酸组氨酸N125ICH2CHCOOHNH2125I－碘代－碘代色氨酸色氨酸1231、直接法－氯胺T法•氯胺氯胺-T-T（（Chloramine-TChloramine-T），化学名叫：），化学名叫：N-N-氯代对氯代对甲苯磺酰胺钠盐，是一种较温和的氧化剂甲苯磺酰胺钠盐，是一种较温和的氧化剂 。

•氯胺氯胺T T在水溶液中水解产生次氯酸，使碘的阴离子在水溶液中水解产生次氯酸，使碘的阴离子氧化成碘分子氧化成碘分子•加入过量的还原剂偏重亚硫酸钠即可以终止反应加入过量的还原剂偏重亚硫酸钠即可以终止反应用量为氯胺用量为氯胺T T的的1.51.5倍倍—2 2倍左右 124注意事项•氯胺氯胺-T-T的用量要适当：的用量要适当：•反应的体积不宜过大：一般在反应的体积不宜过大：一般在100-300μl100-300μl•氯胺氯胺T T在光和空气中不稳定，需新鲜配制在光和空气中不稳定，需新鲜配制•反应体系的反应体系的pHpH值：最佳值：最佳pHpH值在值在7-87-8之间之间 125氯胺氯胺T 法：法：SO2NCH3NaCl+2Na125I+2H2OSO2NHCH3+125I2++NaCl2NaOH温和氧化剂温和氧化剂126⑴⑴反应液组成：反应液组成： Na125I 74MBqMBq（（10μL10μL）） 蛋白质蛋白质 5μgμg（（10μL10μL）） 缓缓 冲液（冲液（pH7.4）） 30μLμL 氯胺氯胺 T 100μgμg（（10μL10μL）） 室温室温1~3min⑵⑵ 加加Na2S2O5 200μgμg（（0.2mL)0.2mL)中止反应中止反应⑶⑶用用SephadexG50柱层析柱层析分离纯化分离纯化 125I-蛋白质蛋白质注意事项注意事项: ⑴⑴ 氯胺氯胺 T 的新鲜度的新鲜度 使用前配制使用前配制⑶⑶ Na2S2O5的用量的用量 中和过量的氯胺中和过量的氯胺 T ⑵⑵ 氯胺氯胺 T 的用量的用量 过量过量 ⑷⑷ 反应时间反应时间, 温度温度, pH（偏焦亚硫酸钠）127•2 2、乳过氧化酶法：、乳过氧化酶法：•少量过氧化氢存在时，乳过氧化酶能促少量过氧化氢存在时，乳过氧化酶能促使过氧化氢将碘离子使过氧化氢将碘离子I I- -转化为活性形式转化为活性形式I I+ +, ,而使蛋白质碘化。

而使蛋白质碘化•优点：对蛋白质的损伤小优点：对蛋白质的损伤小•缺点：标记率比较低缺点：标记率比较低128乳过氧化物酶法：乳过氧化物酶法：乳过氧化物酶乳过氧化物酶 + H2O2 O2（新生氧）（新生氧）标记原理：标记原理：Na125I125I2129⑴⑴反应液：反应液： Na125I 37MBq （（10μL10μL）） 缓缓 冲液（冲液（pH5.6）） 30μLμL蛋白质蛋白质 5μgμg（（10μL10μL））乳过氧化物酶乳过氧化物酶 25ngng（（10μL10μL））H2O2 200ngng （（10μL10μL））室温室温7min⑷⑷ 巯基乙醇（巯基乙醇（10mmol/L10mmol/L））0.5mL(mL(中止反中止反应应) )⑵⑵ H2O2 200ngng （（10μL10μL））室温室温7min⑶⑶ H2O2 200ngng （（10μL10μL））室温室温7min⑸⑸ 加入加入NaI载体溶液载体溶液, 用用SephadexG50柱层析柱层析分离纯分离纯化化 125I-蛋白质蛋白质130注意事项：注意事项：1. 乳过氧化物酶使用前新鲜配制乳过氧化物酶使用前新鲜配制2. H2O2保持低浓度：保持低浓度：< 0.1mmol/L3. 酶的浓度酶的浓度↑，标记率，标记率↑酶的用量酶的用量 < 1% 标记蛋白标记蛋白↓酶自身碘化而引入的放化杂质酶自身碘化而引入的放化杂质1313.3.双酶标记法；双酶标记法；葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶＋葡萄糖＋葡萄糖 H H2 2O O2 2标记原理：标记原理：乳过氧化物酶乳过氧化物酶O2（新生氧）（新生氧）Na125I125I2132⑴⑴反应液：反应液： Na125I 37MBq （（10μL）） 缓缓 冲液（冲液（pH7.0）） 30μL蛋白质蛋白质 5μg（（10μL））乳过氧化物酶乳过氧化物酶 25ng（（10μL））葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 10ng （（10μL））室温室温4~20min葡萄糖葡萄糖(0.5%) 5μL (2) 0.1% 叠氮钠叠氮钠 100μL 中止反应中止反应(3) 用用Sephadex柱层析柱层析分离纯化分离纯化1334、间接法•避免了氧化剂和蛋白质的直接接触，对蛋避免了氧化剂和蛋白质的直接接触，对蛋白质的活性影响较小。

白质的活性影响较小•载体主要是联结到蛋白质分子表面的赖氨载体主要是联结到蛋白质分子表面的赖氨酸或蛋白质的酸或蛋白质的N-N-末端，可以用来标记缺乏末端，可以用来标记缺乏酪氨酸残基的蛋白质酪氨酸残基的蛋白质•引入的载体要引起蛋白质分子的位阻效应，引入的载体要引起蛋白质分子的位阻效应，故不用于分子量故不用于分子量<1<1万的蛋白质的标记万的蛋白质的标记•碘的利用率和标记率均低于直接法碘的利用率和标记率均低于直接法134间接标记法间接标记法(Bolton－－Hunter法法):CH2CH2C－－O －－NHOOOO125I125ICH2CH2C－－O －－NOHOOO+NH2－－CHC－－OCH2CH2C－－HOO125I125INH－－CHC－－O3－－(对羟基苯对羟基苯)丙酸－丙酸－N －琥珀亚胺酯－琥珀亚胺酯125I－标记蛋白质－标记蛋白质蛋白质分子末端氨基蛋白质分子末端氨基Na125ICh－－T(联接试剂联接试剂)135室温室温1~3 min具体操作方法：具体操作方法：⑴⑴碘化碘化：： 琥珀亚胺酯琥珀亚胺酯 0.4μgNa125I 74MBq氯胺－氯胺－ T 50μg（（10μL））Na2S2O5 120μg（（10μL)NaI 2mg苯苯 250μg(2)联接联接: 分离上述苯液分离上述苯液, 移入试管，用移入试管，用N2气吹干后加入气吹干后加入:蛋白质蛋白质 10μgPB(pH8) 50μL室温室温10~30 min甘氨酸甘氨酸(0.2mol) 500μL0℃, 5 min(3)上柱分离纯化上柱分离纯化125I-标记蛋白质标记蛋白质136优点优点二部操作，避免蛋白质变性二部操作，避免蛋白质变性 缺点缺点蛋白质接上琥珀亚胺酯，分子较大，影响活性蛋白质接上琥珀亚胺酯，分子较大，影响活性 标记率低标记率低1375. 固相氧化法：固相氧化法：固相酶法固相酶法: 将乳过氧化物酶等交联在琼脂糖凝胶上将乳过氧化物酶等交联在琼脂糖凝胶上氯甘脲法氯甘脲法:( Iodogen )NNNNOOClClClCl固相氧化剂（温和）固相氧化剂（温和）1,3,4,6-四氯四氯 3a,6a-双苯基甘脲双苯基甘脲138⑴⑴ 1mg 氯甘脲氯甘脲 溶于溶于25mL二氯甲烷，取二氯甲烷，取50μL加入加入3mL试试 管中，用管中，用N2气吹干，在试管底部形成气吹干，在试管底部形成 氯甘脲薄膜氯甘脲薄膜 - 20℃条件下可保存半年条件下可保存半年 （（Iodogen管管））(2)(2)试管中加入：试管中加入： Na125I 37MBq （（10μL10μL）） 缓缓 冲液（冲液（pH7.4）） 30μLμL蛋白质蛋白质 5μgμg（（10μL10μL））室温室温3min(3)(3)取出反应液，上柱取出反应液，上柱分离纯化分离纯化 125I-蛋白质蛋白质特点特点：：标记率高，标记蛋白损伤少标记率高，标记蛋白损伤少杂质少，多为单碘化合物杂质少，多为单碘化合物139碘标记对生物活性的影响•碘原子的掺入量：每一个蛋白质分子上标碘原子的掺入量：每一个蛋白质分子上标记的碘原子越多，对蛋白质生物、免疫活记的碘原子越多，对蛋白质生物、免疫活性的影响越大。

最好保证单碘化性的影响越大最好保证单碘化•蛋白质分子的化学损伤：多是由氧化剂直蛋白质分子的化学损伤：多是由氧化剂直接引起的接引起的•位阻效应：由于碘原子的半径较大，引入位阻效应：由于碘原子的半径较大，引入蛋白质分子后，可能影响其活性中心的构蛋白质分子后，可能影响其活性中心的构型而影响其活性发挥型而影响其活性发挥140•标记好以后的标记化合物一般要鉴定其纯度标记好以后的标记化合物一般要鉴定其纯度•一般的鉴定包括三个步骤：一般的鉴定包括三个步骤： ① ①标记率的测定：标记率的测定： 标记率标记率= =标记物的放射性标记物的放射性/ /投入的总放射性投入的总放射性X100%X100% ② ②分离纯化：分离纯化： 提纯方法主要有层析法，凝胶过滤法，树脂吸附提纯方法主要有层析法，凝胶过滤法，树脂吸附法等 ③ ③标记物的鉴定：标记物的鉴定： 主要是测定标记物的生物学性质、放射化学主要是测定标记物的生物学性质、放射化学纯度、放射性比活度等纯度、放射性比活度等1418.6 标记化合物的纯化和鉴定标记化合物的纯化和鉴定一一. 分离纯化分离纯化纸层析纸层析, 薄板层析薄板层析, 柱层析柱层析(凝胶过滤柱凝胶过滤柱, 离子交换柱离子交换柱)电泳电泳, 高效液相层析等高效液相层析等微量分离方法微量分离方法1. 放射性核纯度放射性核纯度(Radionuclide Purity)2. 放射化学纯度放射化学纯度(Radiochemical Purity)3. 放射性比活度放射性比活度(Specific Activity)4. 标记位置及定量分布标记位置及定量分布二二. 标记化合物的鉴定标记化合物的鉴定:化学纯度化学纯度生物活性生物活性1421. 放射性核纯度放射性核纯度放射性核纯度放射性核纯度% =样品中所需的放射性核素活度样品中所需的放射性核素活度样品总放射性活度样品总放射性活度×100%如：如： 99mTc( 99Mo) 目的目的: 鉴别标记化合物发出射线的种类和能量鉴别标记化合物发出射线的种类和能量, 检查有无其它放射性核素存在检查有无其它放射性核素存在1438.05d（（131I））14.3d（（32P））相相对对放放射射性性10203040day10.10.5(1) 半衰期测定法半衰期测定法：：短短 T1/2 核素核素: 时间跟踪法时间跟踪法144A ( 110Sn + 111Sn )相相对对放放射射性性时间时间(t)1000100104812BACB ( 110Sn T1/2=4 h )C ( 111SnT1/2=35min )混有二种核素样品的半衰期测定混有二种核素样品的半衰期测定145(2)β，，γ射线能谱测定：射线能谱测定： β 、、γ能谱仪能谱仪3HE (keV)计数率14C计数率E (keV)E (keV)计数率3H + 14Cβ 射线能谱测量射线能谱测量146计计数数率率0.662能量能量(MeV)137Cs的的γ能谱能谱137Csγ 0.662 MeV137Baβ 0.514MeV14760Coγ 1.17 MeVγ 1.33 MeV60Niβ 0.313MeV计计数数率率1.17能量能量(MeV)1.3360Co的的γ能谱能谱1482. 放射化学纯度放射化学纯度：：如：如：125I－蛋白质（－蛋白质（ 125I－蛋白质聚合物－蛋白质聚合物 125I－蛋白质水解产物）－蛋白质水解产物）标记化合物最重要参数标记化合物最重要参数表示特定化学形态存在的放射性比例表示特定化学形态存在的放射性比例放射化学纯度放射化学纯度 %=特定化学形态的放射性活度特定化学形态的放射性活度样品总放射性活度样品总放射性活度×100%> 95％％放化杂质放化杂质149测定放化纯度的测定放化纯度的常用方法常用方法放射性产物放射性产物标准品标准品放射化学纯度放射化学纯度 %=特定化学形态的放射性活度特定化学形态的放射性活度样品总放射性活度样品总放射性活度×100%(1) 层析法和电泳法层析法和电泳法纸层析、薄板层析纸层析、薄板层析150(2) HPLC法法 放射性检测器放射性检测器( 常规检测方法常规检测方法 )1513.放射性比活度放射性比活度:测定产品每毫升的放射性活度测定产品每毫升的放射性活度(GBq/mL)测定标记产品的化学浓度测定标记产品的化学浓度(mmol /mL)= 放射性比活度放射性比活度(GBq/mmol)4. 标记位置及定量分布测定标记位置及定量分布测定:降解法降解法 ( 采用特定化学反应或专一性酶采用特定化学反应或专一性酶 ) 14C-质谱法、红外光谱法质谱法、红外光谱法核磁共振：核磁共振： 氚核磁共振分析法氚核磁共振分析法152•由于标记化合物多是一些有机化合物，由于标记化合物多是一些有机化合物，性质不稳定；加上射线对化合物分子性质不稳定；加上射线对化合物分子的作用，所以使标记化合物很容易产的作用，所以使标记化合物很容易产生分解。

生分解•包括初级内分解、初级外分解、次级包括初级内分解、初级外分解、次级分解和化学分解分解和化学分解1538.7 放射性标记化合物的稳定性与贮存放射性标记化合物的稳定性与贮存一一. 放射性标记化合物的分解机理：放射性标记化合物的分解机理：1. 一般的化学分解一般的化学分解: 与放射性无关的水解与放射性无关的水解, 氧化氧化, 聚合聚合, 光学异构以及光、微生物的作用而引起的分解光学异构以及光、微生物的作用而引起的分解 2. 初级内分解初级内分解:由于标记原子的放射性衰变产生子核而由于标记原子的放射性衰变产生子核而导致原标记化合物组成改变导致原标记化合物组成改变154•初级内分解无法避免，半衰期越短，初级内分解无法避免，半衰期越短，比放射性越高的标记化合物，越容易比放射性越高的标记化合物，越容易发生初级内分解发生初级内分解 •若衰变的子核有放射性，则称为放射若衰变的子核有放射性，则称为放射性杂质；若衰变的子核无放射性，则性杂质；若衰变的子核无放射性，则称为非放射性杂质称为非放射性杂质 1554. 次级分解次级分解: 射线先作用于溶剂分子产生自由基射线先作用于溶剂分子产生自由基, 如如 H·，，HO · ，，HO2 · 等。

自由基再与标记分子反应自由基再与标记分子反应3. 初级外分解初级外分解: 射线直接引起化合物电离或化学射线直接引起化合物电离或化学键断裂辐射自分解辐射自分解 (Autoradiolysis)的的主要原因主要原因156相对来说，射程越短，初级外分解越强相对来说，射程越短，初级外分解越强αα、、ββ射线较之射线较之γγ射线射线 更容易产生初级外分解更容易产生初级外分解 电离密度电离密度↑ 自吸收自吸收↑ → 辐射自分解辐射自分解↑ α＞＞β＞＞γ3H ＞＞14C ＞＞35S ＞＞32P能量能量↓ 自吸收自吸收↑ → 辐射自分解辐射自分解↑ 低能量＞高能量低能量＞高能量二二. 辐射自分解的影响因素：辐射自分解的影响因素：3. 标记物的浓度和比活度标记物的浓度和比活度:1. 射线的种类射线的种类:2. 射线的能量射线的能量:比活度比活度↑ → 辐射自分解辐射自分解↑1574. 标记物中杂质及贮存环境：标记物中杂质及贮存环境：放放化化纯纯度度 %1009080841216贮存时间贮存时间 Week2,4,6,7－－3H－雌二醇放化纯度变化－雌二醇放化纯度变化自由基的产生，杂质自由基的产生，杂质加速加速辐射自分解辐射自分解158159在不影响使用的前提下，降低标记化合在不影响使用的前提下，降低标记化合物的比放射性可以减少辐射自分解。

物的比放射性可以减少辐射自分解 三三. 标记化合物的贮存标记化合物的贮存:1. 降低放射性浓度或比活度降低放射性浓度或比活度 加入非加入非标记化合物标记化合物2. 自由基清除剂对标记物贮存的影响自由基清除剂对标记物贮存的影响（（2℃）） （水溶液）（水溶液） 160•次级分解是标记化合物辐射自分解的重要因素若在标记化合物体系中，加入能与自由基发生快速反应的物质，阻止及清除自由基与标记物作用，则可以有效降低标记化合物的次级分解•选用清除剂时，应注意到它本身或它的辐解产物（乙醇辐射分解产生乙醛）不能与标记化合物发生化学或生物化学反应1613. 降低贮存温度降低贮存温度•降低温度，使分解产生的自由基与标记化合物作用的速度减慢，亦能使标记化合物的分解减少•但是，对于标记化合物的溶液来说，当温度下降而发生缓慢冻结时，标记分子被聚集在一起，反而加速自辐射分解162一般储存温度一般储存温度: 不引起溶液冰冻的不引起溶液冰冻的可行的最低温度可行的最低温度水溶液水溶液: 0 ~ 4℃ / 液氮下快速冷冻液氮下快速冷冻 乙醇乙醇 / 有机溶剂有机溶剂: 冰点以上冰点以上163•标记化合物低温储存：低温储存：•1414C C，，3232P P，，3535S S，卤素一般在，卤素一般在-40℃-40℃。

•苯作溶剂的标记化合物则以不使其冻结的苯作溶剂的标记化合物则以不使其冻结的温度为宜，一般以高于其熔点温度为宜，一般以高于其熔点5--10℃5--10℃保保存•3 3H H标记化合物需用液氮快速冷冻保存只标记化合物需用液氮快速冷冻保存只有在有在-140℃-140℃下快速冷冻，标记分子才能保下快速冷冻，标记分子才能保持均匀分散在溶剂中持均匀分散在溶剂中164•4 4、选择适当的溶剂：、选择适当的溶剂：•耐辐射、溶解能力好、高度纯化耐辐射、溶解能力好、高度纯化•5 5、纯化：、纯化：•标记化合物长期储存时应定期纯化标记化合物长期储存时应定期纯化165。