一株聚β-羟基丁酸（PHB）产生菌的分离纯化及鉴定.pdf

实 找化学合成塑料的替代品，即生物可降解塑料，如 ’ PHA、聚氨基酸以及蛛丝蛋白等微生物合成的 PHA有均聚物、共混物和无规则共聚物，其性能 可在塑料和橡胶间变化…已鉴定的PHA约有40 型代 大芽 得到 PHB 的存在 PHB是原核生物细胞内的储能物质，在 细胞内呈颗粒状，分子量一般为106左右，熔点为 180℃，具有高结晶性、光学活性和压电性等性 质与常用的热塑性塑料比较，PHB有相对较高的 E模量I，1PHB来源于生物体，具有生物可降解性， 最终能够被微生物分解利用，不会对环境造成污 染，是一种具有广阔应用前景的生物材料，但由 于其菌的产量不高，生产菌在生长过程中所消耗 的原料价格较高，造成生产成本高，限制了PHB 的广泛应用所以寻找能够利用廉价碳源和培养 原料的微生物资源，进行菌种改良，改善和优化 PHB积累条件，合理有效地控制微生物的生长速 率，进一步提高细胞中PHB积累量，降低生产成 本，是有效加快PHB工业化生产和应用的关键 笔者等试图分离筛选 能够产生和积累PHB且 性能优良的菌株 1材料与方法 l-1 土样 采白兰州 1．2仪器 紫外分光光度仪UV2100，尤尼柯仪器有限公 司；洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；电 子天平，梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司； 恒温鼓风干燥箱CMD一20X，上海琅开实验设备有 限公司；光照培养箱LRH一250一G，广东省医疗器 械厂；低速台式离心机TDZ5一Ws，长沙湘仪离心 机仪器有限公司；高速台式冷冻离心机TGL一16， 长沙湘仪离心机仪器有限公司；高温灭菌器 DSX一280B，上海中安医疗器械厂。

1．3 培养基 1．3．1富集培养基(g／L)尿素5．0 g，葡萄糖1．0 g， MgSO4 0．5 g，K2HPO4 0．1 g，pH值7．0，121℃灭菌 20 min 1．3．2分离培养基(g／L)牛肉膏0．5 g，葡萄糖0．2 g， 琼脂2．0 g，pH值7．0 g，121℃灭菌20 rain 1．3．3平板培养基(g／L)蛋白胨5．0 g，酵母膏1．0 g， 甘油10．0 g，琼脂2．0 g，pH值7．0，121℃灭菌20 rain 1_3．4基础发酵培养基(g／L)蛋白胨5．0 g，酵母 膏1．0 g，甘油5．0 g，葡萄糖5．0 g，pH值7．0，121 cIC 灭菌20 rain 1．4 方法 1．4．1分离筛选方法土样经粉碎后在富集培 养基中培养，然后稀释涂平板，反复纯化，挑取单 菌落，得纯菌株将分离菌株经苏丹黑染色，镜检 PHB颗粒进行初筛，然后将初筛所得菌株通过摇 瓶发酵后，破碎细胞，进行PHB’钡4定，复筛出目的 菌，并进行细菌学鉴定 1．4．2培养方法 250 mL三角瓶中装培养基 50 mL，接一环菌苔后在摇床3O oC 150 r／min培养 24 h取此培养液5 mL接种50 mL发酵液，按上 述条件震荡培养72 h后继续静止培养。

将初筛所得菌株进行摇瓶震荡培养后，离心 实 主 8 PHB 誓翥 篓 提取测定比较后，选出 株积累 较高的菌 ’ 表1 筛选菌株的PHB积累量 2．3富集营养培养 采用富集培养，将平板琼脂培养基中的蛋白 胨增加到1％，酵母膏增至0．5％，甘油增至 1．5％，30℃摇床培养18 h，然后梯度稀释涂布培 养，培养出单菌落 2．4 P一9号菌株的初步鉴定 2．4．1 细菌培养特征平板上菌落扁平，无光 泽，表面光滑，呈典型的丝状菌落，结果如图l在 分离培养液中培养，液体澄清，形成菌膜，摇动时 不易破裂，黏附于管壁，挑取培养物时收缩成黏液 团在发酵培养液中培养，不形成菌膜，丝状体悬 浮于液体中 实 验 技 术 究的价值 图2 菌体特征(A未染色，B苏丹黑染色，1 000 X) 2．4．3生化反应特征 生理生化反应表明，P一9 菌能水解淀粉、接触酶和酪素，V—P反应、硝酸盐还 原反应呈阳性，与葡萄糖作用产酸不产气，孢子囊 没有明显膨胀，可很好地利用糖和有机酸，见表2 按照以上特征和表2中的形态特征，根据伯杰细菌 手册(第8版)细菌P一9初步鉴定为芽孢杆菌属 (Bacillus)菌株【6l 表2 P一9菌形态特征 菌体形态 革兰氏染色 菌体大小 衣鞘 鞭毛 运动 异染颗粒 PHB颗粒 杆状，有芽孢 阳性 (1．1-1．2)×(3．2—5．5) 薄而无色，有粘性，游离的单菌体常附在外边 侧生鞭毛 单菌能活跃运动 有且较大，占菌体的1／3 菌体内PHB颗粒较多，有的占菌体的3／4 2．5 P-9菌株生长曲线及产PHB情况 采用发酵培养基摇瓶培养，每12 h取样，测定细 胞量和PHB产量，重复3次取平均值，制作Bacillus P一9菌的生长曲线与PHB积累曲线(见图3)。

图3 Bacillus P一9生长和PHB产量 2 0 1 5∞ 1 0 ∞ 0 5 凸一 结果表明，该菌株在0—24 h处于延迟期，24 h 后进人生长对数期，同时PHB开始积累，84 h细 胞进入稳定生长期，稳定期细胞量和PHB积累为 最大，即该菌的PHB积累与菌体细胞的生长同步， 属于一步发酵类型【71108 h时Bacillus P一9的细胞 量为2．408×10 个／mL，PHB产量为1．25 g／L 2．6 P一9菌株产生的PHB的红外分析 P一9菌株细胞内提取获得的PHB为白色薄膜 状样品，经红外光谱4 000—500 cm 之问进行扫描 分析，结果如图4所示，在l 724 cm 处有一强烈吸 收峰值，此为羧酸中羰基(C=O)的吸收峰，3 436 cm 处存在O—H伸缩振动，2 976 cm～、2 935 cm～、2 874 cm一处存在一CH3、一CH2、一CH振动，这些都是PHB 的特征峰；此外在1 058—1 287 cm间存在大量C—O 振动，为聚酯的特征峰，说明P一9菌株细胞内PHB 纯度较高 图4 PHB红外吸收光谱 3讨论 由于PHB具有多种优良特性，并且是目前人 5 0 5 O 5 0 2 2 1 1 0 0 7 Il _【 刍0目≈II∞r) 们解决环境问题所需材料的性质，随着人们环保 意识的增强，PHB的开发和应用也将越来越大，其 远景也得到国际上的广泛认可，吸引了越来越多 的各专业力量投入PHB的应用开发，成为国际研 究开发热点I 8I。

在众多产PHB的细菌中，真养产碱 杆菌R．e tropha被研究得最多它在一定的培养 条件下，积累的PHB可达细胞干重的80％以上 它的PHA合成酶只接受3—5个碳原子数的单体， 合成短链PHA(scl—PHA)[91张伟等l10I从污水处理 厂回流池废水中分离到一株北京红篓菌(Rcs． pekingensis strain 3-p)，能够以乙酸、丙酸、丁酸、 琥珀酸等为碳源合成PHB，以乙酸为碳源时，合成 PHB可达细胞干质量的60％j 1利用富集和分离 等方法，从采自兰州的土样中分离出一株积累 PHB的细菌P一9，通过初步鉴定，认为是一株芽孢 杆菌属菌株此菌在营养丰富的环境中生长时，不 易形成鞘，菌体单个，菌落光滑；在缺乏营养的环 境中生长时，菌体易形成鞘，菌体呈丝状，菌落丝 发状该菌是好氧菌，但PHB的积累在氧气不足 时更为有利当培养基碳源耗尽时，细胞内多糖和 PHB开始被利用，但多糖降解的速度更快，所以 控制培养基营养成分和培养时间对PHB的积累 非常重要用红外光谱仪分析其产生的PHB，发现 此菌产生PHB的纯度很高，是一株具有进一步研 究价值的PHB产生菌，有待进一步研究 参考文献： [11徐 军，贺文楠，张增民，等．微生物合成聚羟 基脂肪酸酯Ⅲ．现代塑料加_T应用，2001，13 (1)：55—57． [2 [3 【4 【5 【6 [7 influencing the production of polyhydroxyalka——noa tes-biodegradable plastics[J]．Bioprocess and Biosyst—— emsEngineering，2001，24：131—136． [8】Ezlert H．Relationship between the ph0topr0ducti0n of bydrogen and the accunulation of PHB in non——sulgtur bacteria[J]．Apple Microbiol Biotechnal，1 993，39：87— 93． [9】Lee S Plastic bacteria Progress and prospects for p0lyhydr0xyaIkanoate production in bacteria[J]．Bio— technol Bioeng，1 996，49：1一l 4． [10]张伟，姜成英，戴欣，等．北京红篓菌聚羟 基烷酸合成酶基因的克隆与表达Ⅲ．微生物 学通报，2004，44(3)：332—335． 实 验 技 术 。