疫组化技术-理论篇.ppt

免疫组织化学（理论篇）免疫组织化学（理论篇）(immunohistochemistry)免疫组化的标记物免疫组化的标记物 •酶标记酶标记•胶体金标记胶体金标记•荧光标记荧光标记•放射性标记放射性标记免疫组化的标记物免疫组化的标记物 酶标记：酶标记：•应用最广泛应用最广泛•常用标记物：常用标记物： - -辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP): (HRP): 染色时同时加底物染色时同时加底物H2O2H2O2和供氢体和供氢体（（DABDAB）或）或AECAEC，生成棕色（，生成棕色（DABDAB）或红色（）或红色（AECAEC）） HRP+DABHRP+DAB（（H2H2））+H2O2=HRP+2H2O++H2O2=HRP+2H2O+氧化型氧化型DABDAB呈色呈色 - -碱性磷酸酶碱性磷酸酶(ALP)(ALP)：以萘酚：以萘酚As-MsAs-Ms磷酸盐为底物，快蓝磷酸盐为底物，快蓝FB/FB/快红快红FRFR为呈色剂，生成蓝色为呈色剂，生成蓝色/ /红色沉淀主要用于内源性红色沉淀主要用于内源性过氧化物酶多得血细胞和淋巴细胞过氧化物酶多得血细胞和淋巴细胞 免疫组化的标记物免疫组化的标记物胶体金标记：胶体金标记： 以胶体金做标记物对组织或细胞内的抗原进行定以胶体金做标记物对组织或细胞内的抗原进行定位、定量研究的方法。

胶体金是一种特殊的金属颗粒，位、定量研究的方法胶体金是一种特殊的金属颗粒，呈淡红至深红色，可在光镜下观察胶体金颗粒大小呈淡红至深红色，可在光镜下观察胶体金颗粒大小不同，电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合免不同，电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合免疫电镜观察疫电镜观察免疫组化的标记物免疫组化的标记物 荧光标记荧光标记: : 以荧光素做标记物以荧光素做标记物, ,与其相对应的抗原或抗体起反应后与其相对应的抗原或抗体起反应后, , 形成带有荧形成带有荧光素的免疫复合物上光素的免疫复合物上, ,在荧光显微镜下观察抗原抗体反应结合部位在荧光显微镜下观察抗原抗体反应结合部位, , 对对组织中的抗原或抗体进行定位，定量分析组织中的抗原或抗体进行定位，定量分析常用荧光素：常用荧光素：l异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（Fluorescien isocynate FITCFluorescien isocynate FITC）：黄绿色荧光）：黄绿色荧光l德克萨斯（德克萨斯（Texas red TRTexas red TR）：鲜红色）：鲜红色l罗丹明（罗丹明（Rhodame TRITCRhodame TRITC）红色）红色l花青花青5 5（（Cyanine CY5):Cyanine CY5):蓝色荧光蓝色荧光 免疫组化标记物免疫组化标记物放射性标记：放射性标记： 使用放射性同位素作为示踪物，应用放射性自显使用放射性同位素作为示踪物，应用放射性自显影术对组织中的抗原进行分析。

影术对组织中的抗原进行分析 免疫组化的检测系统免疫组化的检测系统 l过氧化物酶抗过氧化物酶法（过氧化物酶抗过氧化物酶法（ PAP））l碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP））l卵白素卵白素-生物素复合物法（生物素复合物法（ABC））l链酶卵白素链酶卵白素-生物素法（生物素法（LSAB））l抗生物素蛋白链菌素抗生物素蛋白链菌素-生物素复合物（生物素复合物（SABC））l酶标聚合物法（酶标聚合物法（LDP）如）如EnVision法法l增强聚合物一步法（增强聚合物一步法（EPOS））l催化信号放大法（催化信号放大法（ CSA））石蜡切片标本的处理：石蜡切片标本的处理： 组组织织离离体体后后尽尽快快固固定定，，切切开开固固定定效效果果好好，，固固定定液液以以10％％福福尔尔马马林林缓缓冲冲液液为为佳佳，，固固定定时时间间在在4h-24h之之间间，，长长时时间间固固定定会会影影响响抗抗原原决决定定簇簇的的暴暴露露，，产生阴性结果产生阴性结果标本的处理时的注意事项标本的处理时的注意事项 标本的取材厚度以标本的取材厚度以2mm2mm为宜，梯度酒精脱水尽为宜，梯度酒精脱水尽量彻底充分，二甲苯透明时间不宜长，量彻底充分，二甲苯透明时间不宜长，1 1～～3h3h为佳，为佳，透明过度会导致组织发硬发脆。

浸蜡应选择低熔透明过度会导致组织发硬发脆浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分点的石蜡，浸蜡应充分标本的处理时的注意事项标本的处理时的注意事项 切片通常以切片通常以3 3～～4um4um的厚度为宜的厚度为宜, ,太厚易掉片，细胞太厚易掉片，细胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想裱片要求达重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想裱片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（到无皱折、无气泡，水温宜在（4848～～50℃50℃），玻片），玻片用用APESAPES或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性80 ℃80 ℃烘烘烤烤1 1～～2h2h标本的处理时的注意事项标本的处理时的注意事项冰冻切片的处理：冰冻切片的处理： 冰冻切片的组织抗原保存好，缺点是不易做出好冰冻切片的组织抗原保存好，缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象通常以的冰冻切片，易出现冰晶、细胞肿胀等现象通常以5um5um的厚度为佳，冷风吹干后用纯丙酮固定的厚度为佳，冷风吹干后用纯丙酮固定2 2遍遍, ,干燥干燥置入置入4 ℃4 ℃冰箱短期保存，－冰箱短期保存，－20℃20℃冰箱长期干燥保存。

冰箱长期干燥保存标本的处理时的注意事项标本的处理时的注意事项 石蜡切片应用石蜡切片应用3 3％的新鲜％的新鲜H H2 2O O2 2进行封闭，进行封闭， 以阻断内以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min10min 内源性过氧化物酶的封闭内源性过氧化物酶的封闭热抗原修复的缓冲液热抗原修复的缓冲液•有多种不同的修复液，如有多种不同的修复液，如 pH6.0 pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）柠檬酸缓冲液（最常用）、、尿素、尿素、Tris-HClTris-HCl、、商品化修复液等商品化修复液等•碱性碱性 pH pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好修复液常对绝大多数抗体的效果更好•推荐使用：推荐使用：EDTA EDTA 缓冲液缓冲液 pH 8.0 pH 8.0 或或 Tris-EDTA Tris-EDTA 缓冲液缓冲液 pH 9.0 pH 9.0 是较好的常规修复液是较好的常规修复液，，可用于大多数热修复有效的抗可用于大多数热修复有效的抗体（有选择性体（有选择性, , 缓冲液对抗体缓冲液对抗体CD7CD7可能获得结果最佳）。

可能获得结果最佳）•PAPPAP笔画圈时应在组织外围笔画圈时应在组织外围2mm2mm左右，不宜太靠近组织左右，不宜太靠近组织•滴加抗体时应从外周环绕，不直接滴加在组织中间，易浪滴加抗体时应从外周环绕，不直接滴加在组织中间，易浪费抗体•缓冲液中加入适量的乳化剂，可使抗体均匀弥散，节省抗缓冲液中加入适量的乳化剂，可使抗体均匀弥散，节省抗体，如体，如Triton X-100Triton X-100等等 减少边缘效应的方法减少边缘效应的方法。