第十一章 抗生素类药物的分析.doc

第十一章 抗生素类药物的分析[教学目的]一、 掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系二、 掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法三、 掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算四、 熟悉抗生素类药物杂质检查的方法五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查[本章分配学时数] 2学时[教学环节与教学内容][复习引入] 2分钟在上节课，我们进行了甾体激素类药物的分析，要求同学们掌握甾体激素类药物的结构特点与分析方法之间的关系、鉴别原理与方法、含量测定原理与方法以及杂质检查的方法那么，这节课我们就要对抗生素类药物进行分析，经过本章的学习后，要求同学们不仅要掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系，掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法，掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算，还要熟悉抗生素类药物杂质检查的方法，了解抗生素类药物中高分子聚合物检查[教授新课]第一节 概述一、 抗生素药物的特点抗生素（antibiotics）是指“在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称”主要由微生物发酵、经化学纯化、精制和化学修饰等过程，最后制成适当试剂与化学合成药物相比，其结构、组成更复杂，表现为：1. 化学纯度较低三多：同系物多：庆大霉素含有四个主要组分；异构体多：半合成β-内酰胺抗生素均存在光学异构体；降解物多：四环素类存在脱水、差向异构体。

2. 活性组分易发生变异微生物菌株的变化、发酵条件改变等均可导致产品质量发生变化，如组分的组成或比例的改变3. 稳定性差抗生素分子结构中通常含有活泼基团，而这些基团往往是抗生素的活性中心，如青霉素、头孢菌素类结构中的β-内酰胺环，链霉素结构中的醛基等均具有稳定性差的特点二、 抗生素药物的质量分析（一） 鉴别试验（理化方法）1. 官能团的显色反应β-内酰胺环的羟肟酸铁反应、链霉素的麦呀酚反应、坂口反应对于抗生素盐类，通常鉴别酸根或金属离子或有机碱2. 光谱法（红外光谱或紫外吸收光谱）抗生素的红外光谱分析时需注意，由于抗生素存在多晶现象，有时对照品与供试品图谱或对照图谱不一致，最好用相同溶剂同时重结晶供试品和对照品，使处于相同晶型情况下再进行测定，若多晶效应是由于研磨和压片过程中的晶相转变所致，则应采用溶液法试验3. 色谱法TLC和HPLC法，采用标准品对照法4. 生物学法检查抗生素灭活前后的抑菌能力，并与已知含量的对照品对照后进行鉴别二） 检查1. 影响产品稳定性的指标结晶性、酸碱度、水分或干燥失重等2. 控制有机和无机杂质的指标溶液的澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等。

3. 与临床安全性密切相关的指标异常毒性、热原或细菌内毒素、降压物质、无菌等4. 其它指标对于多组分抗生素还要进行组分分析等此外，有些抗生素还规定“悬浮时间与抽针试验”、“吸碘物质”、“聚合物”、“杂质吸收度”等三） 含量测定或效价测定1. 微生物检定法微生物检定法是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生物效价的一种方法该法的设计是根据量反应平行线原理，在实验所用的剂量范围内，对数剂量和反应呈直线关系，供试品和标准品的直线应平行测定方法可分为稀释法、比浊法和管碟琼脂扩散法，后两种为抗生素微生物检定的国际通用方法中国药典采用管碟琼脂扩散法，USP采用后两种方法抗生物管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑制圈通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价2. 理化方法（主要是HPLC法）是根据抗生素的分子结构特特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反应而进行的对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素，能较迅速、准确地测定其效价，并具有较高的专属性不足：（1） 化学方法一定要运用其化学结构上官能团的特殊化学反应，对含有具同样官能团杂质的供试品就不适用，或需采取适当方法加以校正。

2） 当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总含量，并不一定能代表抗生素的生物效价3. 抗生素活性表示方法抗生素的活性以效价单位表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少用单位（u）或微克（ug）表示各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的一种抗生素具有一个效价标准，同一种抗生素的各种盐类的效价可根据其分子量与标准盐类进行换算三、 抗生素的分类1．β-内酰胺类：青霉素：青霉素钾（钠）、阿莫西林、氨苄西林等 头孢菌素类：头孢他啶、头孢拉啶等2．氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素、巴龙霉素、萘替米星、卡那霉素等3．四环素类：四环素、金霉素、土霉素等4．大环内脂类：红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等5．多烯大环类：制霉菌素、两性霉素B等6．多肽类：多黏菌素、放线菌素等7．苯烃胺类：氯霉素等8.蒽环类：阿霉素、紫红霉素等9．其它抗生素（凡不属于上述类型的抗生素）均归于其它类 上诉分类远远不能包括所有抗生素，且某些抗生素可同时划分为几个类型，因此此种分类仅仅是将常用的重要的抗生素列入几大类第二节 β-内酰胺类抗生素本类抗生素包括青霉素霉和头孢菌素族，它们的分子结构中均含有β-内酰胺环，因此统称为β-内酰胺类抗生素。

一、 化学结构与性质青霉素和头孢菌素分子中都有一个游离羧基和酰胺侧链氢化噻唑环或氢化噻唑环与β-内酰胺并合的杂环，分别构成二者的母核青霉素族分子中的母核称为9-氨基青霉烷酸（6-APA）；头孢菌素族分子中的母核称为7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）由此可以说，青霉素族的分子结构由侧链RCO-与母核6-APA两部分结合而成；头孢菌素族是由侧链RCO-与母核7-ACA组成结构见教材P266青霉素分子中含有三个手性碳原子（C3、C5、C6），头孢菌素分子中含有两个手性碳原子（C6、C7）由于酰氨基上R以及R1的不同，构成各种不同的青霉素和头孢菌素性质：1. 酸性与溶解度分子中的游离羧基具有强酸性，能与无机碱或某些有机碱形成盐其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂青霉素的碱金属盐水溶液遇酸则析出游离基的白色沉淀2. 旋光性青霉素族：三个手性碳原子头孢菌素族：两个手性碳原子3. 紫外吸收特性头孢菌素族母核部分具有O=C-N-C=C结构，R取代基具有苯环等共轭系统，有紫外吸收青霉素族分子中的母核部分无共轭系统，但其侧链酰胺基上R取代基若有苯环等共轭系统，则具有紫外吸收特征4. β-内酰胺环的不稳定性β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心，其性质活泼，是分子结构中最不稳定部分，其稳定性与含水量和纯度有很大关系。

干燥条件下较稳定，室温条件下密封保存可贮存3年以上，但水溶液很不稳定，随pH和温度而有很大变化二、 鉴别试验（一） 呈色反应1. 羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色反应式见教材P2702. 类似肽键的反应本类药物具有-CONH-结构，一些取代基有α-氨基酸结构，可显双缩脲和茚三酮反应3. 其它呈色反应侧链含有-C6H5-OH基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应而呈色，如头孢哌酮与重氮苯磺酸试液作用，呈橙黄色此外，本类药物还可与变色酸－硫酸、硫酸、硝酸、铜盐等试剂反应而呈色二） 各种盐的反应1. 钾、钠离子的火焰反应青霉素族、头孢菌素族药品中，许多制成钾盐或钠盐供临床使用，因而可利用钾、钠离子的火焰反应进行鉴别方法见第二章2. 重氮化－偶合反应普鲁卡因青霉素水溶液酸化后，显普鲁卡因芳伯氨基的重氮化－偶合反应，生成红色的偶氮染料沉淀3. 青霉素盐的沉淀反应青霉素钾和青霉素钠，加水溶解后，加稀盐酸2滴，即生成难溶于水的游离基白色沉淀此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或过量的盐酸（与酰胺基成盐）中溶解三） 光谱法1. 红外吸收光谱（IR）红外吸收光谱反映了分子的结构特征，各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。

该类抗生素的β-内酰胺环羰基的伸缩振动，仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动、羧酸离子的伸缩振动是该类抗生素共有的特征峰2. 紫外吸收光谱（UV）本类药物的紫外光谱鉴别法通常采用：（1） 利用最大吸收波长鉴定法：将供试品配成适当浓度的溶液，直接测定紫外吸收光谱，根据其最大吸收波长或最大吸收波长处的吸收度进行鉴定；（2） 利用水解产物的最大吸收波长鉴定法：将供试品在一定条件下水解，测定水解产物的最大吸收波长四） 色谱法HPLC和TLC被各国药典广泛用于本类药物的鉴别试验利用比较供试品与对照品主峰的保留时间（tR）或斑点的比移值(Rf)是否一致进行鉴别HPLC法一般都规定在含量测定项下的色谱图中，供试品和对照品主峰的保留时间应一致中国药典收载的头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物均采用HPLC法进行鉴别三、 特殊杂质的检查（一） 聚合物中国药典对头孢他啶、头孢曲松钠、头孢噻肟钠等规定了各自聚合物的检查二） 有关物质和异构体β-内酰胺类抗生素中的有关物质和异构体通常采用色谱法检查三） 吸收度药典也常采用测定杂质吸收度方法来控制本类抗生素的杂质含量药物检查项目检查方法头孢他啶、头孢曲松钠、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠聚合物HPLC法头孢呋辛酯有关物质和异构体HPLC法头孢氨苄有关物质反相TLC法青霉素钾（钠）吸收度紫外分光光度法链霉素链霉素BTLC法硫酸萘替米星有关物质TLC法庆大霉素庆大霉素C组分HPLC法盐酸四环素有关物质HPLC法四、 含量测定各国收载的青霉素族和头孢菌素族的含量测定除少数几个样品采用抗生素微生物检定法外，大多数采用理化方法，本章主要讨论中国药典收载的方法，如HPLC法、碘量法、电位配位滴定法、可见-紫外分光光度法。

一） 碘量法利用青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，而其降解产物消耗碘的性质，采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量反应步骤：1. 青霉素在碱性条件下水解，该步反应是按化学计量进行的；2. 水解生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠滴定，同时做空白试验反应原理见教材P274碘量法是青霉素族的经典测定方法头孢菌素族和青霉素族一样，也可经碱水解，β-内酰胺开环后与碘产生氧化还原反应，根据消耗的碘量计算含量二） 电位配位滴定法青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产物如青霉噻唑酸在一定条件下能与二价过渡金属离子如Cu2+、Hg2+形成稳定的配位化合物，其可能结构见教材P275电位配位滴定法利用这一性质，采用碱水解后用硝酸汞进行滴定，根据消耗的硝酸汞量可以计算青霉素的含量由于样品中存在的降解杂质也会消耗硝酸汞，为消除干扰，药典采用两次滴定法，即水解后滴定（总量）与直接滴定（降解杂质量），然后分别计算含量，两次测定所得含量差即为样品的含量讨论：1. 水解必须完全溶液的pH值和反应时间直接影响水解的完全程度，水解如不完全，将使测定结果偏低；2. 本法空白实验的作法与碘量法类似，即空白实验时也要称取供试品，但不经氢氧化钠水解。

空白实验的目的也是为了消除供试品中可能存在的降解产物的干扰；3. 与碘量法比较，汞。