激光共聚焦扫描显微ii.docx

激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微系统显微观察方式全光谱激光共聚焦显微扫描系统 OLYMPUS FV1000S激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具 有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器激光共聚焦显微镜利用激光作 为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和 PMT 的收集，并带 有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件与传统光学显微镜相比，它具有更高的分 辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点所以它问世以来在生物学的研究领域中 得到了广泛应用激光共聚焦显微镜是一种高级的荧光显微镜，其在高分子化学材料方面已经有了非常广泛的应用聚 合物多组份体系的研究已发展成为高分子材料科学的重要领域，而其材料性能又与体系中各组份的相容性 及相态结构密切相关目前，研究多组份聚合物共混体系形态结构最常用的方法有电子显微技术，如扫描 电镜法(SEM)和透射电镜法(TEM)、X-射线光电子能谱法(XPS)、原子力显微镜法(AFM)、直接无辐射能 量转移法(DET )等，这些方法中有的可以从分子水平上获得共混体系中各组份相互作用或形态结构的信息， 但也各自存在一些局限性，如有的方法对样品的要求较为苛刻，制样比较复杂，而更主要的是它们或为表 面分析方法，只能给出表面结构的信息；或者只能获得宏观平均结构图象，如果要了解材料的层次形态结 构及其分布，就要破坏样品，XPS虽可以给出表面以下的组成分布，但只能提供约100A厚度以内的信息。

激光共聚焦荧光显微技术是一种无损的多层形态观测的新方法，它提供了有效的途径弥补上述各种手 段的不足之处其检测深度可达100呻，制样简单、快速、图象直观由于它是光学观察方法，因此其分 辨率较电镜为低，约0.2gm另外，为了得到一定的反差，进行观察前，需对多组份聚合物体系中的某一 (或某些)组份进行荧光标记可得到比普通荧光显微镜更高分辨率、更高灵敏度的图像，并有效地保护 标本不仅在X-Y平面，同时在Z轴方向，可获得样品不同深度层面的信息，即光学切片或断层扫描，而 无需破坏样品另外，获得的图像信息通过相关软件的帮助，可对标本各深度层面的信息进行三维重建， 可以得到表面及内部结构都非常清晰的三维图像因此，在生物学、医学、高分子材料、生物化学、胶体 化学(如研究胶体分散相中乳胶颗粒的分布、排列、热运动及器壁效应等)等众多研究领域，激光共聚焦 技术都有着广泛的应用激光共聚焦扫描显微系统实验结果激光共聚焦扫描显微系统实验结果激光共聚焦扫描显微系统实验结果激光共聚焦扫描显微系统实验结果设备简介：处于世界领先地位的奥林巴斯 FluoView® FV1000 共聚焦显微镜，是为适应当今生物科研趋势而推出 的新型的点扫描、点探测共聚焦显微镜，作为最新一代的活细胞成像工作站， FV1000 给 21 世纪的生物 科研工作带来一系列尖端的前沿应用科技，为科研最前线的研究者提供先进易用的平台。

在 FV1000 各种功能当中，应用两束激光进行刺激和扫描成像同步的双扫系统( SIM Scanner )可以说 最为瞩目应用高效离子沉积镀膜技术的滤光片，增加了系统的灵敏度，同时高速的扫描振镜与光谱分光 检测装置的结合，使光谱成像的分辨率可以精确到 2nm FV1000 扫描单元提供高敏感度的检测系统，并且带有高速扫描和激光反馈电路，在观察活体标本， 尤其是观察快速的生理动态变化时， FV1000 仍然能获取最好质量的图像图像的扫描可以选择各种分辨 率，最高达到4096x4096，每个通道4096个灰度级(12-bit )，确保能够观察到最细微的图像细节 FV1000 扫描单元应用新的光谱成像技术，利用光栅分光技术提供目前世界上最精确的光谱分辨率与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清 晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性：1、 对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三 维图像2、 可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。

3、 多维图象的获得，如7维图象(XYZaNIt): xytxzt和xt扫描，时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光 谱扫描、同时方便进行图像处理4、 细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态 变化5、 荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体， 核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察；6、 对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存主要组成：激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统 2、扫描装置 3、激光光源 4、检测系 统整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行特点和用途：• 完成对活细胞和组织或切片进行连续扫描，获得精细的单个细胞或一群细胞的各个层面结构三维图像• 可进行发射光谱光谱扫描取图，对于重叠光谱进行拆分，实现荧光共定位的应用；• 利用荧光标记，测定细胞内如钠、钙、镁、 PH 等离子浓度的比率及动态变化；・具备光刺激扫描单元，实现荧光寿命的荧光衰减分析（FLIP）和荧光漂白后恢复（FRAP）、荧光共振 能量转移分析（FRET）的应用・ 同时可以做多重荧光标记信号检测。

・ 利用荧光标记测定活体细胞内如钠、钙、镁、 PH 等离子浓度的比率及动态变化能对信号进行快速和 精确的定位、定时和定位分布的观察・进行细胞损伤、荧光光漂白及恢复技术（FRAP）、荧光共振能量转换实验（FRET）、解笼锁（UNCAGE） 等光刺激（光漂白）实验、方便进行细胞间通讯研究・ 完成图像分析和 3D 重构等分析当前，激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛：1. 细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器 结构和分布变化、细胞凋亡等；2. 生物化学：酶、核酸、FISH、受体分析等；3. 药理学：药物对细胞的作用及其动力学等；4. 生理学：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态等；5. 遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体 分析、基因表达、基因诊断等；6. 神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递等；7. 微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构等；8. 病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性 疾病的诊断等；9. 生物学、免疫学、环境医学和营养学：免疫荧光标记（单标、双标或三标） 的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的 共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位等。

激光共聚焦扫描显微镜管理规定一、实验预约制度使用激光扫描共聚焦显微镜者，须提前3天预约（日期，时间，样品数），以便安排实验时间取消预约者请至少提前 1 日说明，对于取消预约但不按规定提前说明者按照预约时间照常收费二、标本要求及仪器使用规定 自备样品，本系统仅用于制备好样品的观察分析，不负责样品染色等前期准备工作1. 标本准备：切片标本需加盖盖玻片，最好用专用抗荧光淬灭的封片剂；普通培养板及培养瓶只能用 10X 、20X物镜观察，如需用高倍物镜观察，必须用专用培养板（壁厚＜ 0.17 mm）2. 实验开始：请准时进行实验，以免仪器空开3. 实验中：每次实验的实验者请不要超过 2 人，进入实验室必须穿戴鞋套无关人员请不要私自进入实验室激光器的打开和关闭、物镜的安装、更换和清理等仪器操作均由本实验室工作人员进行4. 实验结束：按照操作规程关闭激光器，填写实验登记并签字清理物镜，保持清洁5. 数据刻录：在实验结束后，按照使用时间交费后方可刻录数据注：基于系统的安全性要求，光盘由本室提供，不可使用可擦写光盘三、收费标准请进行测试者提前到生命科学平台办公室（综合楼 C103 ）开交帐户头预交费，测试后消费。

收费以小时为单位计，最小单位是 1 小时， 不足 1 小时按 1 小时计算；校内 100 元/小时，校外 400 元/小时一次性交费10小时可以享受测试15小时的优惠对于首次测试者，可以赠送数据刻录光盘1张，此 后数据输出光盘收费， 2 元/张四、注意事项1. 放置激光共聚焦设备的房间内要根据技术要求严格控制温湿度，因为温度和湿度的变化对光学系统影响非常大，尤其该设备扫描头非常精密，有一点变化将严重影响仪器性能和软件对硬件的识别2. 除借阅图书、文件及样品扫描观察外，不准在任何时间随便进入共聚焦房间，进出请随手关紧拉门。