实验四-小鼠精子畸形试验-课件.ppt

EXPERIMENT,3,经口急性毒性实验,,,,,下一张,上一张,开 始,结 束,实验目的,实验内容,实验材料,实验步骤,实验结果,结果分析,,,南京晓庄学院,,,,,,,,院 系：生化环院,任课老师：吴雨龙,任课班级：09食品、行09食品,食品专业,食品毒理学实验,院 系：生化环院食品专业食品毒理学实验,,精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法通过实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤实验四 小鼠精子畸形试验,,,实验目的,,1.,1.,精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精,精品资料,精品资料,,你怎么称呼老师？,如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？,你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？,教师的教鞭,“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……”,“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”,实验四-小鼠精子畸形试验-课件,,,实验原理,,2.,,精子畸形,是指精子的形状异常和异常精子数量的增多生殖系统,对化学毒物的作用,十分敏感,，在其他系统还未出现毒性反应前，生殖系统可能已出现了损害作用。

正常情况下,，哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量可大量增加因此，可以用,,实验原理2. 精子畸形是指精子的形状异常和异常精子,,,实验原理,,2.,检查雄性动物接触化学毒物后,精子畸形率,的高低，来反映该化学毒物的,生殖毒性,和对生殖细胞潜在的,致突变性,化学毒物引起精子畸形的机制尚未完全清楚正常情况下，精子的成熟和正常形态发生过程受多种基因调控，一旦这些基因中的一个或多个在化学毒物的作用下发生突变，就会导致,畸形精子数量,的大量增加一般认为，常染色体上的基因控制,,实验原理2.检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低，来反,,,实验原理,,2.,精子畸形，Y-性连锁基因控制畸形精子的表现某些特异的染色体,重排,，如,性、常染色体易位,，是化学毒物诱发哺乳动物畸形率增高的主要机制由于精子畸形有可能影响生殖因此，当受检物引起,精子畸形率增高,，即使不一定是化合物诱发生殖细胞突变的结果，但也表明受试物,直接或间接损害精子,，从而可能影响生殖实验原理2.精子畸形，Y-性连锁基因控制畸形精子的表现。

某些,实验动物：,,,实验材料,,3.,体重18-22g小鼠实验器材：,灌胃针、注射器5套、眼科剪、眼科镊、显微镜、饲养笼等实验试剂：,磷酸盐缓冲液、生理盐水、无水乙醇、2%伊红水溶液、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酸或环磷酰胺实验动物：实验材料3.体重18-22g小鼠实验器材：灌胃针,,,,4.,实验步骤,1.动物选择成熟的大鼠、小鼠均可使用由于小鼠较为经济，且有大量实验证实小鼠在该试验系统中对化学毒物最为敏感，故一般采用,雄性小鼠,，年龄宜在,6～8周,2.剂量与分组试验至少应设,3个以上剂量组,，并同时设立,阳性对照组,和,阴性对照组,接触化学毒物后每组至少应存活5只动物最高剂量组5d总剂量应能使部分动物死亡一般可采用,LD,50,的2～4倍剂量,，或预先给予化学毒物的LD,50,，以求得最高总剂量，然后以它的,1/2（或1/5、1/10）,作为下一剂量组的接触剂量，依此类推4.实验步骤1.动物选择成熟的大鼠、小鼠均可使用由于小鼠较,,,,4.,实验步骤,阳性对照可用,环磷酰胺20mg/kg或甲基磺酸甲酯75mg/kg,或,甲基磺酸乙酯60mg/kg,，进行腹腔注射，每天一次，,连续5d,。

阴性对照选用给予相同体积的溶剂3.染毒与采样可采用一次或每天一次连续5d的方法进行染毒染毒途径多用,腹腔注射,，也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，,如经口、吸入和皮肤接触等,一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感，在接触化学毒物后,4～5周,精子畸形率最高，故选择在第一次染毒后第,35d,进行采样也可在染毒后,第1、第4,和第,10周,4.实验步骤阳性对照可用环磷酰胺20mg/kg或甲基磺酸甲酯,,,,4.,实验步骤,分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连续进行动态观察，直至精子形态恢复正常4.制片用,颈椎脱臼法,处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取,双侧附睾,，将附睾放入盛有约3ml磷酸盐缓冲液或,生理盐水,的小平皿中，以眼科剪将附睾尾剪成小块，用吸管将悬浮液轻轻吹打,5～6次,，静置,3～5min,，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定,5min,，干燥后即可镜检观察精子形态也可用,2%的伊红水溶液染色1～2h,后再作镜检4.实验步骤分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连续进行动,,,,4.,实验步骤,5.阅片在高倍镜下检查精子形态，可加上,蓝色或绿色,滤光片。

每只小鼠检查完整的精子,200～500个,，每个剂量组至少检查,1000个精子,精子畸形主要表现在精子的头部，可分为：,无钩,、,香蕉形,、,无定形,、,双头,、,双尾,、,尾折叠,及,胖头,等,形态头部重叠或全部重叠的精子、无尾精子不进行计数4.实验步骤5.阅片在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或绿色,,,,5.,结果分析,分别计算各剂量组的,精子畸形发生率,各剂量组的,精子畸形率,与,阴性对照组,之间的差异分析采用秩和检验由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差异较大，且影响的因素也较多，故在结果分析时，应首先观察,阳性,和,阴性,对照组的试验结果阳性对照组精子畸形率的增高应在本实验室的历史记录范围之内，并与阴性对照组有,显著性差异,（P<0.01），阴性对照组的畸形精子率也应与自己实验室的历史记录接近，否则所得结果不可靠，试验应重做5.结果分析　分别计算各剂量组的精子畸形发生率各剂量组的精,,,,5.,结果分析,出现可重复的剂量反应关系时，可判断,试验结果为阳性,但要判定某一化学毒物为精子畸形诱变剂，至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率比阴性对照组,显著增高（P<0.01）,；或达到阴性对照组的2倍或2倍以上，并且试验结果能够重复。

如果试验组的染毒剂量已使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果为,阴性,在受试化学毒物的毒性作用较低而不至于引起动物死亡时，应当记录最大的染毒剂量5.结果分析　出现可重复的剂量反应关系时，可判断试验结果为阳,,,,5.,结果分析,精子畸形试验还可进行畸变类型分析，不同部位的畸形对精子的活动能力和使卵子受孕的能力有不同的影响可以结合,精子计数,、,精子运动能力试验,等对化学毒物对雄性生殖系统的毒性作用做进一步的检测5.结果分析　精子畸形试验还可进行畸变类型分析，不同部位的畸,,,,6.,注意事项,1．在该试验过程中，虽然将精子悬液采用离心等方法除去组织残渣后再制片效果会更佳，但这使制片过程变得复杂化且更易造成人为误差2．在镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、双头、双尾及多尾畸形等假象3．在结果判定时，要注意排除机体某些如缺血、变态反应、感染和体温增高等可能导致精子畸形率增高的因素，以免造成假阳性结果6.注意事项1．在该试验过程中，虽然将精子悬液采用离心等方法,双尾精子,双尾精子,胖头精子,胖头精子,。