[化学]生物转化常见反应类型.ppt

第三章 介绍生物转化的常见反应类型以甾体化合物的生物转化为例进行阐述• 甾体化合物和甾体药物简介甾体化合物结构甾类化合物常见种类甾体化合物和甾体药物简介• 1952年，美国普强药厂的Morray和 Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化 为11黄体酮，人们开始认识到甾体微生 物转化在甾体药物生产中的重要性 • 微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转 化 • 几种重要的甾体微生物转化发应如羟化， 脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物 的重要手段甾体化合物• 一类含有环戊烷多菲核的化合物 • 在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在 3，11,17位，可能有羟基、酮基；A，B 环有部分双键；17位有不同的测链目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域• 将微生物基因工程的新技术应用于甾体微 生物转化 • 提高水不容性底物的溶解度 • 细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利 用 • 发展经济有效的产物连续回收方式 • 将环糊精等应用于培养基以提高产量甾体化合物结构甾体化合物编号甾类化合物常见种类动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。

植物中：薯芋皂豆甾醇酵母细胞：麦角固醇甾体类激素药• 肾上腺皮脂激素类可的松、强的松、氢化可的松功能：抗炎、抗毒、抗过敏对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治 疗作用 • 生殖腺激素孕酮、雌酮功能：调节内分泌 • 人工合成避孕药长效孕酮等微生物在甾体药物生产中的应用主要分为两大类 • 将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体，雄甾－4－烯－3，17－二酮；雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮 • 转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所 需要的产物如：甾体11，11及16羟化，∆1 脱氢甾体边链降解微生物对甾体化合物的转化• 微生物对甾体化合物的转化多种多样 • 它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可 能进行生物转化 • 其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等 等 • 包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化 、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、 开环、形成内酯、侧链断裂、降解羟基化反应Ø是甾体微生物转化中最重要的反应 Ø化学法除了较容易在C17引入羟基外，在 其他位置都很难引入羟基 微生物对甾体的羟基化作用• 微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应 ，也可在非甾类有机分子上羟基化。

• 简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引 入O原子 • 在甾核上至少有21个位置可以发生 • 11位羟基化作用最重要，11位C的氧化对可 的松药物疗效是不可缺少的，11，11 • 除11位C进行羟基化反应外，9，14，16 的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾 类化合物及其类似物进行甾体羟基化作用的微生物转转化物质质作用位置微生物代表孕酮酮11 11黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等弯曲孢孢霉化合物S11 11黑根霉、黑曲霉、焦曲霉构巢曲 霉假单孢单孢 杆菌、弗氏链链霉菌、梨 头头霉11脱氧皮脂酮酮11弯月弯孢孢霉雌二醇16巨大芽孢孢杆菌羟基化反应机理羟基化反应由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因 此被定义位单氧化酶 这种细胞色素p450依赖的单氧化酶存在于几 乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的 形式存在同位素实验证明甾体羟基化中存在的问题环糊精的生理作用Hesselink等研究： 应用环糊于分枝杆菌 甾体边链的降解 • 环糊精是一种环状寡聚糖，一般由6－8个 葡萄糖分子通过－1，4糖苷键连接而成 • 易溶于水 • 含有疏水性空腔，可与疏水性分子结合 • 可作为几种甾体类药物的稳定剂和增溶剂 。

环糊精的应用实例1• Chincholkar 等研究了在环糊精存在时 ，Currularia VKMF-644对11－脱氢皮甾 醇（Reichstein S化合物，简称化合 物S）的11羟基化 在底物浓度为4g/L时： • 化合物S： －CD＝1.0:0.6 氢化可的 松的产率为70％－75％ • 无－CD： 氢化可的松的产率 为40％－50％环糊精的应用实例2• GD：19－去甲基－13－乙基雄甾－ 4－烯－3，17－双酮 • 经Penicillium raistrickii进行15 羟基化――――口服避孕药∆5－D－ 十八甲基炔诺酮（gestodene）的重 要中间体 • Schlosser等研究表明：在－环糊 精存在时，菌株或其固定化细胞对 CD的15羟基化作用，与以甲醇做溶 剂比较，其转化率都能明显提高环糊精作用• 环糊精有利于提高甾体底物溶解度• 真菌能以环糊精作为C源其他重要的羟基化反应• 地索高诺酮（destogestrel） 新型避孕药（荷 兰Organon公司推出） • 作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠 • 我国研究：上海医科大学史纪平 • 19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－ 双酮―――11羟基化（金龟子绿僵菌）形成 关键中间体 • 简化合成路线，降低副反应。

• 底物：0.2% 转化率：36％甾体的边链降解侧链降解• 微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾 体化合物作原料合成甾体激素的问题，为 利用原价的原料开辟了新的途径 • 常见微生物有： • 简单节杆菌 • 球形芽孢杆菌 • 玫瑰芽孢杆菌 • 淡紫青霉 • 藤黄诺卡氏菌• 甾体边链降解• 甾体母核降解3－羟基－∆5甾醇 9羟基化，∆1，2脱氢3－酮－∆4化合物 微生物种类不同∆1，2脱氢，9羟基化甾体边链降解• 采用类似脂肪酸氧化的氧化过程，最后 形成C17酮甾体选择性边链降解问题• 选择性边链降解策略（3）辅助基因工程• 提高边链降解的产率策略选择性甾体边链降解措施1• 对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降 解例如：1965 Sih等 将胆固醇先行改造为19羟 基衍生物再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮选择性甾体边链降解措施2• 加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C 1，2 脱氢酶和9羟化酶如： Ø Ni Co Pb Se Ø 8－羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的 选性边链降解 Ø 金属鳌合剂 2，2－双联吡啶 抑制母核降解选择性甾体边链降解措施3• 对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变 株例如： • 原始菌株经诱变为诱变菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683 不加抑制剂，便产生雄甾－1，4－二烯－3， 17－二酮（ADD） • 再诱变得Mycobacterium sp，NRRL-B3805，无C 1，2脱氢酶能产生雄甾－4－烯－3，17－二酮（AD）基因工程新技术的应用专利： • Pseudomonas 菌株无降解甾体的能力 • 将Mycobacterium sp NRRL-3683 的 DNA导入Pseudomonas 菌株中获得重组 菌。

• 重组菌可在水相，一种或几种有机相中进 行转化反应 • Pseudomonas 菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生长输率快 • 结果加快转化进程，降低成本方法• 分离纯化Mycobacterium sp NRRL- 3683 的DNA • 整合到特定质粒载体中 • 导入噬菌体中 • 用入噬菌体感染E.coli HB101，得E.coli 重组子 • 三亲杂交实现Mycobacterium sp NRRL- 3683 的DNA到Pseudomonas 菌株得转 移如何提高甾体边链降解的产率接触提高甾体边链降解速率• Hesselink等研究表明：环糊精能明显增 强Mycobacterium sp NRRL-3683 降解 胆固醇、谷甾醇等边链生成AD的产率， 不影响细胞生长速度和细胞密度 • 当环糊精：底物浓度=2:1时，微生物降解 边链的活性可增加1.7-3.0倍 • 环糊精能阻止母核的降解及产物的反馈抑 制环糊精在甾体边链降解中的 作用总结• 在甾体边链降解过程中，环糊精充当： • 惰性甾体增溶剂 • 反应载体 • 保护剂甾体边链降的成功应用Arhna 和Sih等研究报道以胆甾醇和－谷甾醇为原料 微生物转化法合成甾体药物中间体的方法。

• 采用酶抑制剂 • 生化阻断变株 • 改变细胞膜通透性等生物技术改造甾醇的结构，从 而选择性控制甾醇的边链降解 成功合成中间体雄甾－4－烯－3，17－二酮（4－ AD）雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD）9羟基－4－AD 目的：工业生产性激素，利尿剂等甾体药物其他的甾体生物转化反应类型• 脱氢作用• A环芳香脱氢作用－使甾体核形成双键强的松（去氢可的松）是可的松经脱氢而形成的其抗炎功效比可的松高几倍一般制 备该种药物时，常常是将可的松或氢化 可的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化 可的松脱氢反应的常见微生物为简单节杆菌各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢 杆菌）镰刀霉长蠕孢菌属A环芳香化所谓A环芳香化是指甾体A环核上的每个C原子都脱氢 形成双键，而变为芳香化结构雌性激素的生产（雌二醇），可通过此 方法获得研究生物转化的几种常用方法第四章 研究生物转化的几种常用方法• 间歇培养法 • 整体细胞转化法 • 洗涤均丝悬浮法（静息细胞法） • 孢子转化法 • 原生质体实验法 • 遗传特性诱变法 • 同位素示踪法间歇培养法（Batch culture)这种方法能够比较直接而简单地筛选能否具 有转化某种化合物的活性菌株。

游离的整体细胞• 游离的整体细胞直接作为催化剂来制造产品的报道已经不少• 在某种程度优于固定化细胞• 在生物转化酶工程中越来越受到重视• 游离整体细胞的基础研究更为重要游离整体细胞的基础研究内容• 细胞的渗透化• 酶的胞内固定化• 酶细胞在反应前后的形态变化和结构变化整体细胞转化应用举例• 底物：富马酸• 产物L－天冬氨酸• 生物转化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）• 转化菌株：E.coli整体细胞转化研究培养基培养方法不同底物浓度的反应速率• 底物质量浓度较高时，在某一时间（8h） 前，转化速率较低，而后，反应速度加快 对底物富马酸盐的转化彻底99.2％） • 底物浓度较低时，反应速度始终较慢对底物富马酸盐的转化不彻底63％） 特点： • 高质量底物浓度有较高的反应速率 • 高质量浓度底物有较高的转化率 • 催化反应一般有个迟滞期酶细胞在生物转化中的形态变化 低底物浓度扫描观察酶细胞在生物转化中的形态变化 高底物浓度扫描观察形态学变化• 高质量底物浓度下细胞发生明显的形态学变化• 细胞表面发上皱褶，有明显的凹陷• 细胞膜变薄，松弛、不明显，内部结构变松，不致密高质量浓度底物对含酶细胞的渗透化作用静息细胞法为了排除原培养基中自身的代谢产物对不同生长阶段转化的影响，常常用洗涤的静息细胞来代替发酵液中的生长的细胞，即将不同生长阶段的细胞取出，洗去沾染的原培养液及其代谢产物，然后把细胞悬浮在人工转化系统内，在一定条件 下进行生物转化。

孢子转化法真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶 活力高，且常常用于生物转化细菌的内生孢子（芽孢），一般无转化活性 转化方法相似于静息细胞法不采用完全培养基，只选用缓冲液或含有 葡萄糖一类能源的物质即可通常转化时使用的孢子浓度为108－109个 /ml.转化pH一般为5-6原生质体试验法方法通过溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等脱去 细胞壁，获得原生质体将原生质体悬浮于高渗稳定液中，添加 前体物质，进行喂养试验，观察结果原生质体试验法特点排除了细胞壁通透性障碍 保全了整体细胞的内酶系统 避免了无细胞抽提法中，用破碎细胞而损坏 了酶体系，从而使某些需要偶联的酶反应 （氧化还原反应）不能进行的缺点遗传特性诱变法菌种诱变不仅是提高产量的重要手段，而且也是 研究生物转化过程中，产物形成的遗。