第六章 微生物菌种的筛选与保藏.ppt

第六章 微生物菌种的选育第一节 从自然界中分离筛选菌种1、生产菌株来源 • 索取或购买• 自己选育Ø 用原有菌株进行遗传改造进行育种Ø 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选Ø 从自然界中分离菌种从自然界中分离菌种就是从自然界微生物 资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌 种设计方案→采样→增殖培养*→平板分 离 →筛选(初筛、复筛)→单株纯种分离 →性能考察(生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤一、采样 从自然界种采集含目的菌的样品 1.环境条件对土样本中微生物分布的影响•营养环境 •水分 •温度 •通风 •酸碱度2.采样方法（1）去除表层土（2）取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中3.注意• 记录：时间，地点，环境情况等• 样品袋应封好口，防止水分失去• 土样应在分离前破碎• 尽快分离二. 增殖培养（富集培养）• 适用：样品中目的菌数量不够多时• 目的：提高样品中目的菌的数量和比例• 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌 得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制1、增殖培养的 方法 § 控制营养成分 § 控制培养基pH § 控制培养温度 § 热处理——增殖芽孢细菌 § 添加抑制剂三. 纯种分离§ 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获 得纯培养 1. 纯种分离的一般方法 （1）稀释平板法 倾注平板或涂布平板 （2）划线法 （3）组织分离法*适用于分离高等真菌及植物病原菌稀释分离涂布平板稀释分离倾注平板2、平皿反应快速检出法——定性或半定量§ 纸片培养显色法 § 透明圈法§ 变色圈法§ 生长圈法§ 抑制圈琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序3、厌氧性微生物的分离法 （1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh （2）创造无氧环境物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐 化学除氧 H2 + O2 → H2O (钯作催化剂） ØGASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠 化学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 （3）厌氧分离（培养）技术§ 高层琼脂柱技术 § 厌氧罐技术 § 厌氧手套箱技术GasPak厌氧手套箱厌氧培养装置四 、筛选• 初筛、复筛：好氧培养五、培养工艺条件试验与生产试验 1、摇瓶发酵条件培养基组成、初始pH、通风量（装液量）、接种量 、培养温度… 2、小型台式发酵罐发酵工艺条件溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂…第二节 基因突变突变（Mutation）定义：遗传物质核酸（DNA或病 毒中的RNA）的分子结构或数量突然发生了可遗传的 变化。

Ø 突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变从 而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它的等 位基因 Ø突变体：带有突变基因的细胞或个体 Ø突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相 对的原存在状态称为野生型21一、 突变类型按变化范围分突变类型 (一)染色体畸变（chromosome aberration)染色 体数目的变化或染色体结构发生较大片 段的异常改变1、染色体数目的变化 • 整倍体(euploidy)：含有完整的染色体组 • 单倍体：haploid • 二倍体：diploid • 三倍体：triploid • 四倍体：tetraploid• 非整倍体 aneuploidy：含有不完整状态的染 色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员 的增加或减少 • 单体（二倍减一，monosomic diploid): 2n-1 • 缺体（二倍减二，nullisomic dilpoid): 2n-2 • 三体（二倍加一，trisomic diploid): 2n+1 • 四体（二倍加二，tetrasomic diploid): 2n+2 • 双二倍加一（double trisomic）: 2n+1+ 1 • 部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生 物中由一整条染色体和外来的一个染色体片 段所构成的不完整二倍体。

2、染色体结构的变化• 缺失 deletion： • 重复 duplication ： • 倒位 inversion： • 易位 translocation ：b f(二) 基因突变（gene mutation）----染色体局部座位内的变化• 点突变：只涉及DNA分子中一对或少数几对 碱基的改变突变发生在一个基因范围内 • 多位点突变：突变超出一个基因范围 1、碱基置换 base replacementDNA链上的某一碱基对为另一碱基对所取代 • 转换 transition ： • 颠换 transversion：(3) 遗传学效应• 错义突变 missense mutation：• 同义突变 silent mutation：• 无义突变 nonsense mutation：2、移码突变 frameshift mutation：由于一对或少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或 缺失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框 发生移位错误的突变Phe Asp Glu Pro Leu Cys Thr5’-TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG-3’↓G→A mutationPhe Asp Lys Pro Leu Cys Thr 5’-TTC GAT AAG CCC TTG TGC ACG-3’↓C→T mutationPhe Asp Lys Pro Leu Cys Thr 5’-TTC GAT AAG CCT TTG TGC ACG-3’↓C→A mutationPhe Asp Lys Pro Leu Stop Thr 5’-TTC GAT AAG CCC TTG TGA ACG-3’Phe Asp Glu Pro Leu Cys Thr5’-TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG-3’↓Insertion of APhe Asp Lys Thr Leu Val His 5’-TTC GAT AAG ACC CTT GTG CAC G- 3’二、按表型效应分突变类型• 野生型 wild type：表现该物种正常表型的生物。

• 突变型 mutant：由于突变导致其正常的表型发生 了改变的生物 • 形态突变型 • 生化突变型 • 营养缺陷型 auxotrophic mutant • 抗性突变型 resistant mutant 3. 致死突变型 4. 条件致死突变型 5. 调节突变型三、基因突变的规律不对应性或自发性、随机性 、 稀有性、 独立性、稳定性、 可逆性、 诱变性 、 1、自发突变的证实 随机性、不对应性1）波动实验 2）涂布实验 3）影印培养实验波动实验E.coli B 抗噬菌体a的波动测验结果培养皿编号培养皿上菌落数 样品来自同一培养物样品来自不同培养物 11446411021556200031352230042148107051565500861444253031726494000816512501920564030101347764815111071012040130191400151016017170111864019002035平均值值16.751.43.311.35303.8方 差15273.8694662040.8四、突变的频率： • 突变率（mutation rate）：每个细胞每一世代 中发生突变的概率。

v世代总数=N2-N1v突变率的测定： • 固体平板法测突变率：m=(M2-M1)/(N2-N1) • 液体培养法测突变率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2- g1) • 液体稀释法测突变率：P0=e-mN v细胞分裂非同步性效正：突变率=ln2m=0.69m五、自发突变的机制Ø环境因素的影响Ø微生物自身产生的代谢物的影响Ø转座子所造成的插入突变ØDNA复制过程中偶尔发生错误六、诱变剂及其诱变机制诱变是指通过人为的方法，利用物理、 化学因素处理微生物而引起的突变一) 物理诱变剂1）辐射：uv，x-射线γ-射线等效应：点突变或染色体畸变机制：直接作用和间接作用间接作用：辐射作用于染色体外物质，产 生具有诱变作用的物质；直接作用：辐射直接作用于染色体， 2）热：机理复杂 • 离子束:能量传递、动量交换，离子沉积与电荷积累 过程1、紫外线 UV • 有效波长 2650Å，紫外灯波长 2537 Å • 作用机理 嘧啶二聚体、嘧啶水合物、 交联作用、DNA链断裂• 效应： 移码突变，碱基置换紫外线诱发胸苷二聚体2、电离辐射：x-射线，g-射线• 作用机理 直接作用：打断化学键 间接作用：通过自由基打断化学键 • 效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变 3、热• 作用机理：脱嘌呤 • 效应：碱基置换，移码突变 4、离子束(二) 化学诱变剂 • 碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入 到DNA分子中的一类化合物。

主要诱变剂：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤；可诱发AT GC的转换碱基类似物 base analog 5-溴尿嘧啶(5-BU，BU), 5-氟尿嘧啶(5-FU，FU), 5-氨基尿嘧啶(5-AU，AU), 2-氨基嘌呤(2-AP，AP) 8-氮鸟嘌呤（8-NG，NG） 例：BU 烯醇式：BUe，高频出现，BUe ≡G 酮式： BUk，低频出现， BUk=A5-BU掺入后的掺入错 误G ≡ CG ≡ BUeG ≡ CG ≡ BUeG ≡ CA=TA=BUkA:TA: BUkA:TG ≡ BUeA:TG ≡CG ≡ BUeG ≡ C→A=T5-BU复制错误A: T → G ≡ C2. 移码诱变剂Ø嵌入DNA 分子相邻碱基对之间，从而 有利于核苷酸的环出，因此可提高移码 突变的突变率 Ø主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭 (ethidium bromide)，ICR系列化合物等部分移码诱变剂 DNA 插入剂3.化学修饰碱基的诱变剂1）烷化剂：使DNA分子的碱基发生烷化反应，从 而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂常用的有：硫酸二乙酯(DES)，甲基磺酸乙酯 (EMS)，亚硝基乙基尿(NEU), 亚硝基胍(NTG), 乙烯亚胺(EI)等。

NTG（亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制 叉，可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂Chemical reactivity of bases is responsible for some DNA lesionAlkylated bases部分烷化剂和烷化碱基alkylating agentsDNA的脱嘌呤 烷化鸟嘌呤的碱基配对 烷化鸟嘌呤的交联作用 • 如甲基黄酸乙脂（EMS）使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结 果产生的O-6-E-G和 O-4-E-T分别和T、G配对 ，导致G∶C对转换成A∶T对；T∶A对转换成 C∶G2) 亚硝酸（introus acid, NA）有氧化脱氨作用 ，可使G第2个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌 呤（xanthine,x），次黄嘌呤 (H) 仍和C配对 ，故不产生转换突变但C和A脱氨后分别 产生U和次黄嘌呤H，产生了转换，使C∶G 转换成A∶T，A∶T转换成G∶C3) 羟胺（NH2OH）只特异地和胞嘧啶起反应，在 第4个C原子上加-OH，产生4-OH-C，此产 物可 以和A 配对，使C∶G转换成T∶A • 作用：与C反应，造成GC→AT转换七、DNA损伤的修复1、光复活作用 photoreactivation2、切补修复 exc。