罗非鱼眼透明质酸的提取。纯化及抗氧化性研究.ppt

罗非鱼眼透明质酸的提取、降解及 抗氧化性研究报告人：陈 辉Ø 研究背景及意义Ø 罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析Ø 罗非鱼眼透明质酸的降解研究Ø 低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究目 录研究背景Ø 我国是世界最大的罗非鱼生 产国，发展势头迅猛， 2000 年的产量为62.9 万吨，2010 年增加到133.2 万吨， 2012 年达到145万吨，占世界罗非 鱼总产量的38.30%，位列世 界前位；Ø 罗非鱼的加工产品主要为冻 鱼片，其加工过程中产生的 下脚料多达50%～60%，这些 下脚料大多被废弃，少量被 加工成廉价的饲料，不仅造 成损失也给环境带来污染研究背景及意义罗非鱼眼含有丰富透明质酸，具有较大的研究价值，透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种糖胺聚糖，其具有独特的黏弹性和生理功能， 广泛用于医学、食品 、化妆品等领域研究背景及意义研究现状1.HA的主要制备 方法 u 组织提取法用于提取HA的动物组织主要有玻璃 体、人脐带、鸡冠 、 蛋壳膜、蛙皮、关 节滑液、软骨、鸡 胚等研究背景及意义u 微生物发酵法：用于生产的菌种主要 有兽疫链球菌(C群)、 马疫链球菌(C群)、类 马链球菌(C群)、缺乳 链球菌(C群) 。

研究背景及意义研究意义罗非鱼产业加工下脚料量大、利用率低、污染环境，还在一定程度上增加了产品的成本，如何更好地利用这部分资源，提高罗非鱼原料的附加值，是罗非鱼产业急需解决的问题本课题从提高罗非鱼原料利用率出发，开展从罗非鱼眼提取透明质酸制备高抗氧化活性透明质酸的研究 研究背景及意义罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析研究 要点1 透明质酸的提取纯化2 透明质酸的特性分析IEC乙醇 沉淀1 HA提取工艺流程图冷冻 干燥超 声超滤 浓缩酶 解粗提液酶解液CTAB 络合透 析粗 品 二浓缩液粗 品 一纯品HAHA溶液罗非鱼眼预处 理（研碎、脱 脂） 浸取除 杂 质精制除 杂 质罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析2 结结果与分析2.1 单因素试验：选取酶种类、酶用量、酶水解时间、超声波处理时间和超声波功率进行单因素实验，以透明质酸的得率为参考指标分别考察该五种因素对HA提取的影响，结果如下：罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析酶解 时间酶用 量增加酶的用量，HA的得 率也随之增加，酶用量 达到7500 U·g-1时HA的 得率最大罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析随着酶作用时间的增加 HA的得率呈现先上升后 下降的趋势，在第5 h达 到最大值酶种类对HA的提取效果 有较大影响，其中胰蛋 白酶、中性蛋白酶、复 合蛋白酶提取效果较好酶种 类类罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析超声 功率逐渐增加超声波的功率 ，HA的得率也随之增加 ，200 W时达到最大值超声 时间随着超声时间的增加HA 得率先上升后下降，当 时间达到15 min时HA的 得率最高2.2 正交实验：为进一步考察酶解条件对透明质酸提取效果的影响，根据单因素实验的结果在不改变超声波的功率及超声处理时间的前提下，以透明质酸的得率为参考指标考察酶解温度、时间、pH、酶用量对透明质酸提取的影响，因素与水平见表1：罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析2.3 纯化：罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析HA离子交换层析洗脱曲线HA紫外光谱HA红外光谱罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析HA的质量参考指标1. HA的最优工艺条件为：超声波功率200 W、超声处理15 min、复合酶（胰蛋白酶和复 合蛋白酶的酶活力比1: 1的混合物）、酶解3 h 、酶解温度40 ℃、pH 9.0、酶用量6000 U·g -1，利用最佳工艺条件提取透明质酸的得率为11.44%。

2. 本工艺主要采用CTAB络合法、离子交换层析法、透析及超滤对透明质酸粗品进行纯 化，其纯度达到97.47%，紫外图谱在260 nm 、280 nm波长处无紫外吸收，红外光谱图和标准品一致罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析罗非鱼眼透明质酸的降解研究研究 要点1 透明质酸的降解工艺的优化2 低分子量透明质酸的特性分析• 本研究比较了微波降解法、H2O2结合Vc降解 法、微波结合H2O2+Vc降解法对透明质酸降 解的影响，主要参考指标为LMWHA相对分子 量以及葡萄糖醛酸含量的变化罗非鱼眼透明质酸的降解研究罗非鱼眼透明质酸的降解研究罗非鱼眼透明质酸的降解研究罗非鱼眼透明质酸的降解研究降解 温度随着温度的升高HA的相 对分子量迅速降低，当 温度升到60 ℃时下降趋 势趋于迟缓H2O2：Vc随着H2O2和Vc的比例降 低HA的分子量逐渐下降 ，当二者之间的比例为1: 1时达到最小值二、 降解工艺的优化：罗非鱼眼透明质酸的降解研究H2O2 添加量H2O2浓度越大HA降解效 果越好，当浓度达到3 mmol·L-1时分子量的变化 趋势趋于平缓降解 pHpH4时，HA的降解效果 最好，pH偏离4时，体系 降解能力开始下降，pH 越大降解能力越差降解时间时间在反应初期HA的分子量 下降迅速，30 min后随 着时间的延长降解逐渐 趋于稳定。

罗非鱼眼透明质酸的降解研究红外 光谱LMWHA和HA的红外吸收 光谱一致，降解未对HA 的基本结构造成较大影响紫外光谱谱两组紫外光谱基本一致 ，实验组260 nm处出现 微弱的吸收峰GlcA含量实验组GlcA的含量大于 对照组，说明降解时HA 的糖环有少部分遭到破坏小 结微波结合H2O2+VC降解工艺的最佳条件为： 温度60 ℃、H2O2: Vc为1: 1、H2O2的添加量为 2~4 mmol·L-1、降解pH4，30 min，降解得到的HA相对分子量小于2 KDa，可根据需要改H2O2: Vc、 H2O2添加量、pH制备特定分子量LMWHA LMWHA葡萄糖醛酸含量34.96%，略低于HA ；其红外光谱与HA类似，说明该工艺对透明质酸 的基本结构未造成破坏；紫外光谱260 nm处出现微弱吸收，该吸收可能缘于降解产生的不饱和键 ，总体来看该降解工艺对HA结构破坏较小，是一 种良好的降解HA的方法罗非鱼眼透明质酸的降解研究低分子量透明质酸的制备及其抗 氧化性研究研究 要点1低分子量透明质酸的制备2低分子量透明质酸的抗氧化性研 究二、 LMWHA的制备：低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究随着酶作用时间的增加 HA的得率呈现先上升后 下降的趋势，在第5 h达 到最大值二、 LMWHA的结构分析：红外 光谱紫外 光谱谱增加酶的用量，HA的得 率也随之增加，酶用量 达到7500 U·g-1时HA的 得率最大低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究LMWHA1的还原力远大 于后三者，在不同的浓 度下均差异性显著（ P<0.05） DPPHLMWHA1的清除效果最 好，明显大于其他三者 ，各浓度条件下均差异 性显著（P<0.05） 还原力还原力还原力二、 LMWHA的体外抗氧化研究：低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究不同分子量 大小的 LMWHA均 有较强的清 除羟自由基 的能力，且 清除能力差 异性较小， 差异性不显 著（p<0.05 ） ·OH 低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究低分子量透明质酸的制备及其抗氧化性研究ü 利用微波结合过氧化氢+抗坏血酸法降解罗非鱼眼透明 质酸，制备不同相对分子量的LMWHA，并通过红外光 谱、紫外光谱分析其结构变化。

ü 通过研究LMWHA对•OH 、DPPH自由基的清除作用以 及还原力来考察LMWHA的抗氧化能力结果显示，随 着LMWHA分子量的减小其对DPPH的清除率以及还原 力增大，而对•OH的清除率减小，这种差异可能与 LMWHA清除自由基的机理有关罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析总 结ü 最佳的工艺条件为：超声波功率200 W、超声处理15 min、复合酶（胰蛋白酶和复合蛋白酶的酶活力比1:1 的混合物）、酶作用3 h、温度40 ℃、pH 9.0、酶用量 6000 U·g-1，利用此工艺条件提取HA得率为11.44%； ü 通过CTAB络合、超滤、透析以及HiTrapTM DEAE FF 离子交换柱层析法对HA粗品进行纯化，最终产品纯度 为97.47%，紫外图谱在260 nm、280 nm处无吸收， 表明样品中无蛋白质和核酸等杂质； ü 利用粘度法测量知透明质酸相对分子量大小为100 KDa，红外光谱图显示其吸收峰和标准品基本相同；总 结总 结总 结罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析ü 利用粘度法测量知透明质酸相对分子量大小为100 KDa，红外光谱图显示其吸收峰和标准品基本相同； ü 微波结合过氧化氢+抗坏血酸法降解HA的工艺条件为 ： 温度60 ℃、H2O2: Vc为1: 1、过氧化氢的添加量为 2~4 mmol·mL-1、pH 4、30 min，最终可得到LMWHA 相对分子量小于2 KDa；由LMWHA的红外光谱和紫外 光谱可知，该降解工艺对HA的结构破坏较小；总 结罗非鱼眼透明质酸的提取纯化及特性分析ü 利用微波结合过氧化氢+抗坏血酸法制备分子量分别 为小于5 KDa、5~10 KDa、10~30 KDa、30~60 KDa 的LMWHA，体外抗氧化实验发现随着LMWHA分子 量的减小其对DPPH的清除率以及还原力增大，而对 •OH的清除率减小。

其原因可能是LMWHA清除DPPH 以及还原力的大小依赖于其糖环上双键的数量，而清 除•OH能力大的大小则依赖于LMWHA链上羟基以及 其螯合过渡金属离子的能力总 结本研究优化了罗非鱼眼透明质酸的提取、纯化以及 降解工艺，并比较了对不同分子量LMWHA的抗氧化 能力，初步分析了其抗氧化机理，为罗非鱼眼HA的 实际应用提供了一定的理论基础和技术支撑，由于 时间和条件所限，今后的研究工作可以从以下几方 面开展： 研究时发现罗非鱼眼玻璃体含有较多蛋白，可对这 些蛋白进行研究，以增大罗非鱼眼应用价值； 本文对LMWHA抗氧化机理的研究还不够深入，其确 切 机理还需要进一步的探讨； 进一步开展水产品透明质酸在食品、化妆品、医药 等方面的研究，扩大其应用价值工作展望攻读硕士期间发表的论文发表论文4篇，出刊1篇，3篇在投，专利一篇1.陈辉, 于刚, 高瑞昌，等. 水生生物来源透明质酸的生化特性及 其制备的研究进展[J]. 食品工业科技, 2013, 9(34): 364-367;2.陈胜军，陈辉，高瑞昌，等. 超声波辅助酶解法提取罗非鱼眼 透明质酸工艺条件的研究[J]. 核农学报, 已修回定稿，待刊；3.罗非鱼眼透明质酸的降解研究[J]. 中国食品学报, 已投稿；4.低分子量罗非鱼眼透明质酸的制备及其抗氧化性研究[J]. 食品 工业科技，在投； 5.一种罗非鱼眼透明质酸的提取方法, 申请号: 201310245290.1.感谢高瑞昌老师、陈胜军老师、 于刚一直以来给我的帮助和指导 ！感谢食品学院、南海水产研究所 加工室的各位老师对我的鼓励和 帮助向论文答辩委员会的主席、专家 、老师致以最诚挚的谢意！请专家、老师批评指正！请专家、老师批评指正！陈 辉 江苏 · 镇江 二零一四年六月。