AT2受体对成年大鼠心肌成纤维细胞ET1蛋白及其mRNA水平的影响医学论文.doc

AT2受体对成年大鼠心肌成纤维细胞ET1蛋白及其mRNA水平的影响_医学论文 【关键词】 心肌成纤维细胞；　AT2受体；　AT1受体； ET1　 　1材料和方法 　　1.1材料　　雄性SD大鼠，体质量230~250 g（西安 交通 大学医学院实验动物中心提供）；血管紧张素Ⅱ（angiotensin II，AngⅡ），受体特异性阻断剂（PD123319）（美国Sigma公司）；氯沙坦（losartan，Los）（美国Du Pont &Merk Pharmaceuticals公司）；RTPCR试剂（美国Promega公司）；内皮素1(endothelin1, ET1)放免试剂盒(解放军总 医院 科技开发中心放免所)；兔抗大鼠AT2 多抗(武汉博士德公司). 　　1. 2方法　　1.2.1大鼠心肌成纤维细胞的分离培养　　采用西安交通大学医学院生 理学 与病理生理学教研室已建立的胶原酶Ⅰ，胰蛋白酶消化及差速贴壁的方法分离培养原代心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs). 细胞培养至亚融合状态经12 h无血清预适应后, 进行药物干预.　　1.2.2免疫组化测定　　AT2表达将细胞分为6组：对照组，1 mol/L AngⅡ组，10 mol/L Los组和0.1, 1, 10 mol/L AngⅡ+10 mol/L Los组. 药物作用48 h后进行常规免疫组化.　　1.2.3RTPCR检测　　ET1 mRNA水平将细胞分为3组：AngⅡ组，AngⅡ+ Los组，AngⅡ+ PD123319组. 药物浓度均为10 mol/L,作用48 h后抽提细胞总RNA逆转录合成cDNA, 进行30个循环的扩增（94℃变性，1 min; 65℃或57℃退火，1 min; 72℃延伸，1 min）；72℃延伸5 min. ET1引物：sense: 5′CAGGTCCA AGCGTTGCTCCTGCTCCTCC3′; antisense: 5′CACCACGGG GCTCTGTAGTCAATGTGCTCG3′, 产物长度483 bp. βactin: sense: 5′CCTGT ACGCCAACACAGTGC3′; antisense: 5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′, 产物长度211 bp. 琼脂糖凝胶电泳后扫描DNA条带灰度，以ET1与βactin的比值作为半定量指标.　　1.2.4放免法检测　　ET1的分泌将细胞分为4组：对照组，Ang Ⅱ组，Ang Ⅱ+ Los组，Ang Ⅱ+ PD123319组，药物浓度均为10 mol/L,48 h后收集细胞上清液，按ET1放免试剂盒说明书进行测定，检测范围：10~2000 pg/mL.　　统计学处理: 数据以x±s表示, 用SPSS 10.0统计软件进行方差分析, P<0.05为差异有统计学意义.　 　2结果 　　2.1AT2 受体的表达　　在6组细胞中，仅在10 mol/L AngⅡ+ 10 mol/L Los组观测到AT2受体呈现高表达，其余各组没有表达AT2受体，呈阴性结果.　　2.2ET1mRNA的表达　　半定量统计分析结果显示：ET1 mRNA水平在AngⅡ组，AngⅡ+ Los组和AngⅡ+ PD123319组分别为0.883±0.031, 0.881±0.023和 0.860±0.040, 与AngⅡ组相比较，Los阻断AT1受体和PD123319阻断AT2受体，对ET1mRNA的表达未见影响（n=6， P>0. 05，图1）. 　　2.3ET1的分泌　　ET1在对照组，AngⅡ组，AngⅡ+ Los组和AngⅡ+ PD123319组细胞上清液中的水平分别为：（99.83±13.87 ）pg/mL，（166.30±14.56）pg/mL，（98.23±13.01）pg/mL和（112.47±15.93）pg/mL，统计分析结果显示：AngⅡ诱导可显著增加CFs分泌ET1；Los和PD123319均可下调ET1 的分泌（n=9， P<0. 05 ）. 与AngⅡ组相比，Los阻断AT1受体下调ET1的分泌约为25.1%；PD123319阻断AT2受体下调ET1的分泌约为14.2 %（P<0. 05 ）.　 　3讨论 　　许多研究表明AngⅡ可促使CFs分泌ET1，ET1能刺激CFs增殖，ET1作用于CFs还能诱导ET1基因自身的表达，且17betaoestradiol能抑制AngⅡ诱导的ET1基因的表达［1］. AngⅡ增加ET1的表达是其诱导CFs增殖和间质纤维化的关键因素［2］. AT2受体在成人机体仅限于几个器官的低水平表达，但在组织重塑和炎症中表达增强，蕴涵着可能的病理意义［3］. 有研究发现AT2受体在信号转导机制上与AT1受体存在显著差异［4］. 我们的研究表明：AngⅡ能使成年大鼠CFs分泌ET1显著增加；Los阻断AT1受体和PD123319阻断AT2受体，在ET1mRNA水平上都没有产生影响；但在蛋白质水平，两者都减少了ET1的分泌. 说明AT2受体以转录后机制参与了AngⅡ对ET1的分泌. AT2受体在某些病理状况下表达增加会显现其效应，阐明AT2受体的作用可为心肌重塑的防治开辟新的方向.【 参考 文献 】 　　［1］Chao HH, Chen JJ, Chen CH, et al. Inhibition of angiotensin II induced endothelin1 gene expression by 17betaoestradiol in rat cardiac fibroblasts［J］. Heart, 2005,91(5): 664-669.　　［2］Clozel M, Salloukh H. Role of endothelin in fibrosis and antifibrotic potential of bosentan ［J］. Ann Med, 2005,37(1):2-12.　　［3］Steckelings UM, Kaschina E, Unger T. The AT2 receptorA matter of love and hate［J］. Peptides, 2005,26:1401-1409.　　［4］蒋小英，高广道，王新凤, 等. 血管紧张素Ⅱ受体阻断对心肌成纤维细胞信号转导相关基因表达谱的影响［J］ . 生 理学 报，2006，55（6）: 515-615.。