保护碱基列表.docx

11月 13 日引物合成的详解1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法DNA合成仪有很多种，主 要都是由 ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相 同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时 的多少亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物 比较稳定的特点亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3,端向5,端合成的，相 邻的核苷酸通过3，—5，磷酸二酯键连接第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三 氯乙酸反应，脱去其5，-羟基的保护基团DMT，获得游离的5，-羟基第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑 混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3,端被活化，5,-羟基仍然 被 DMT 保护，与溶液中游离的 5,-羟基发生缩合反应第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5，-羟基没有 参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应， 这种短片段可以在纯化时分离掉第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上再 以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤，直到 所有要求合成的碱基被接上去合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜 色判定合成效率通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等 手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀沉淀后的引物用水 悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？♦ C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附， 可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分它不 能有效去除比目的片段短的小片段实际上，它是一种脱盐的作用这 种方法一般不会对普通PCR反应产生影响对于需要用于测序、克隆的 引物不能使用这个级别♦ OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段OPC法纯化的 DNA纯度大于95%适用于40mer以下引物的纯化♦ PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片 段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化法也是一种 非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA （大于50mer）的纯化特别有效♦ HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进 行纯化纯度可以大于99%主要用于短链和修饰引物的纯化该法的 弱点是成本较高，批量生产效率不高3. 引物的0D数如何定量？答：引物合成引物0D数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm, 石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度测定时溶液的光密度 最好稀释到0.2T.0之间°DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后， 用1ml水稀释测OD值需要根据稀释倍数换算出母液的OD值4. 需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化根据实验需要，确定订购引物的纯度级别应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增<45 baseOPC一般PCR扩增>45 basePAGE诊断PCR扩增< 40baseOPC, PAGEDNA测序20base左右OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定PAGE反义核酸根据实验要求定PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC5. 最长可以合成多长的引物？答：引物越长，出现问题的概率就越大。

有的公司合成过120base的引 物，产率很低除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目 前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百 分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低6. 需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500 次50ul标准PCR反应如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足 够了但是有些研究人员，就做几次PCR,但是却要5-10 0D做全基 因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高0D数片段 越长，最后全长得率就越低，出错的几率就越大超出需要之外的0D 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部 分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功7. 如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法是用PAGE方法使用加有7M尿素的16%的聚丙 烯酰胺凝胶进行电泳取0.2-0.50D的引物，用尿素饱和液溶解或引物 溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95°C,2mins）加入尿 素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样o 600V电压进行电泳， 一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型， 在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用EB染 色或银染方式染色8. 如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定引物一般配制成10-50pmol/ulo 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加 水的体积（微升）按下列方式计算：V （微升）=0D数* （乘）33 * （乘） * （乘）20000 / 除）引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单 上获得如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算注意：1 OD260= 33 ug/ml.9•如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4°C(G + C)+ 2°C(A +T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x LoglO[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size公式中，Size =引物长度Tm 的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3majorparameters:Thesequence:aGC-richsequencehasahigher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物(含修饰)的分子量是如何确定的？答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有 明确的标示。

如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量 为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量或按下列公式 计算 MW二(NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) + (Nx * Wx) +( Ni* Wi) +16* Ns- 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod,Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A 混合的分子量为(313.21+329.21) /2 = 321.21Ns为硫代数目，硫代 每个位置增加分子量16常规碱基分子量：BaseA CG TI UMolecular Weight313.21289.18329.21304.19314.2290.17常规修饰基团分子量修饰基团分子量修饰基团分子量5'-Biotin405.453'-TAMARA623.605'-(6 FAM)537.463'-Dabsyl498.495'-HEX744.133'-(6 FAM)569.465'-TET675.243'-Amino Modifier C3153.075'-Cy5533.633'-Amino Modifier C7209.185'-Cy3507.593'-Thiol Modifier C3154.1211.如何溶解引物？答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上 在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。

根据计算出的体积加入去离子 无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏 水的pH值比较低(pH4-5)，引物在这种条件下不稳定12.如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质 引物在溶解前，室温状态下可以长期保存溶解后的引物-20 度可以长 期保存如果对实验的重复性要求较高，合成的0D数较大，建议分装, 避免反复冻融修饰荧光引物需要避光保存答：合成的引物 5'为羟基，没有磷酸基团如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5,端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5/或 3’端进行磷酸化，需要另外收费14. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？ 连接反应需要引物的 5'磷酸基团如果需要将合成的引物退火直接连 接相应的载体上，引物需要磷酸化磷酸化的产物如果还不能连接载体 上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件SiRNA分子 具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度15. 测序发现引物有突变是怎么回事？ 答：测序发现引物区域有突变，特别是40 个碱基以下的引物, 发生的 概率不大，但是肯定也会发生。

用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多核 酸合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误发生这种突变 的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题引物合成的固 相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数 的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似， 没有人可以超脱引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品 不可以避免引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过 程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去。