第一次实验 动物总蛋白提取定量及SDS-PAGE.doc

实验一 动物组织蛋白质的提取【目的要求】1、掌握动物组织蛋白质的提取方法 2、了解动物组织蛋白质提取的原理实验原理】 由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必经过提取直接进行分离蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。

蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液本实验采用CWBio公司的蛋白抽提试剂盒（该试剂盒带有蛋白酶抑制剂混合物，可有效避免蛋白提取过程中蛋白的降解提取动物组织总蛋白试剂器材】动物组织、蛋白提取试剂盒、1.5 ml离心管、-20℃储存的冰块【操作步骤】1、 动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次2、 称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟3、 10,000g 离心15分钟4、 收集上清，进行下一步的实验注意事项】在整个制备过程中使组织始终置于冰上，以防蛋白质的降解实验二 蛋白质的定量（BCA法）【目的要求】掌握BCA法测定蛋白质含量的原理和方法实验原理】BCA（Bicincho ninic Acid）蛋白定量法是目前广泛使用的蛋白定量方法之一，可对蛋白质进行快速、稳定、灵敏的浓度测定其原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物。

在562 nm 处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量用已知浓度的蛋白作为标准品制作标准曲线，根据标准曲线查出未知蛋白浓度本实验采用CWBio公司的BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度本试剂盒含有牛血清白蛋白（BSA）溶液作为蛋白质标准品溶液，测定范围为20～2000 ug/ml试剂器材】BCA蛋白定量试剂盒、试管及试管架、吸管、分光光度计操作步骤】 1、 制作标准曲线管号稀释液用量（ul）BSA标准品用量（ul）BSA标准品最终浓度（ug/ml）101002000220020010003200200（从2管中取）5004200200（从3管中取）2505200200（从4管中取）1256400100（从5管中取）25720000（空白）2、 稀释样品溶液：样品1：取20微升蛋白样品加入180微升稀释液 样品2：取10微升蛋白样品加入190微升稀释液3、 配置BCA工作液：取试剂A 20ml，加入试剂B 0.4 ml，混匀注意：新配制的BCA 工作液室温密封条件下可稳定保存24 小时4、 向步骤1和步骤2的试管中各加入2 ml BCA 工作液，充分混匀，37℃水浴中孵育30分钟。

5、 将各管冷却至室温6、 用分光光度计测定562nm处每个样品及BSA标准品的吸光值，同时做好记录注意：BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深因此所有样品的测定需在10 分钟内完成，否则会影响蛋白定量的准确度7、 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度注意：数据处理时需要去除明显错误的值未知样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数如果是计算机绘制得曲线，可以从计算机给出的线性方程式计算出未知样品的浓度实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】 1、掌握掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理2、学习蛋白质垂直板电泳技术【实验原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED加速反应聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）； ②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）因此，样品分离效果好，分辨率高SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。

另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数因此，可通过蛋白质分子量标准蛋白估计目标蛋白分子量本实验采用化学聚合法制胶，进行不连续的凝胶电泳，并用考马斯亮蓝快速染色，观察动物组织中的总蛋白 【试剂与器材】 （一）试剂1、 30% 的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于 100 mL去离子水中，用3号新华滤纸过滤至棕色瓶中，4℃ 避光贮存（1）2、 1.5mol/L Tris-buffer,pH8.9： Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH2O 至200 mL）3、 1mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 12.1g Tris base 溶于40mL ddH2O中，加1mol/L HCl 96mL, 加水补至100mL.4、 5Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3):（配1L）Tris-base 15.1g + 甘氨酸94g + 5g SDS + H2O至1L（用时稀释5倍）。

5、 10% SDS：称10克SDS溶解于100mL去离子水中，贮存于室温中6、 TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10%，20 mL，4℃保存7、 10% AP（过硫酸铵）：10 mL，新鲜配制，分装至1.5mL 离心管中，－20℃保存待用（2）8、 样品溶解液：内含1% SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液 9、 考马斯亮蓝染色液(3)：0.05 g考马斯亮蓝R250溶于25 mL异丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O 至110 mL，用滤纸过滤除去不溶物10、 脱色液：75 mL冰乙酸 + 50 mL甲醇 + 875 mL H2O（若只配500 mL，各物质减半）（二）器材 电泳仪垂直板电泳槽、电泳板、微量进样器、染色/脱色摇床 （三）蛋白电泳1、胶板模型的安装：将玻璃板洗干净，晾干，备用制胶时，选择合适的玻璃板，组装胶板模型2、按下表配方配置分离胶溶液(10 ml，可供两块板使用)，用手轻摇混匀, 小心将混合液注入准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间（～2.5cm）,轻轻在顶层加入0.5ml去离子水覆盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制作用。

刚加入水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消失，不久又出现界面，这表明凝胶已聚合再静置片刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25℃室温）去离子水30% 凝胶贮备液1.5mol/L Tris-buffer,pH8.910% SDS:TEMED10% AP（过硫酸铵）4.35 ml3 ml2.5 ml100 ul10ul40ul3、浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的水吸去，再用滤纸吸干残留的水液按下列配方制备浓缩胶溶液：混合后将其注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡的出现去离子水30% 凝胶贮备液1mol/L Tris-HCl, pH6.810% SDS:TEMED10% AP（过硫酸铵）3.6 ml0.67 ml0.625ml50 ul10ul40ul4、在浓缩胶聚合的同时，将蛋白样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸水或微量恒温器（100℃）中加热5分钟，马上插入冰上冷却待用5、浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1X电泳缓冲液，小心地拔出梳子，检查有无漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡6、按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋白浓度而定(1 mg或者20ul/孔)，一孔加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白作对照。

7、电泳：开始时电压为约100V，待染料浓缩成一条线开始进入分离胶后，将电压增到约130V，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源8、剥胶：取下胶板，从底部一侧轻轻撬开玻璃板，用手术刀切去浓缩胶，并切去一小角作记号9、固定及染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝染色液染色并固定，最好放在摇床缓慢旋转1-2小时10、脱色：先用水洗去染料，再放入脱色液中浸泡，更换脱色液3-4次，约4-8小时或过夜11、将脱色后凝胶中的蛋白质分离色带照相或干燥，也可无限期地用塑料袋封闭在含20%甘油的水中 【注意事项与提示】 （1) 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴手套两者聚合后即无毒性，但为避免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上手套操作另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸2) 考马斯亮蓝R-250(三苯基甲烷）染。