预防幽门螺杆菌感染的基因工程疫苗实验研究.pdf

中山大学博士学位论文预防幽门螺杆菌感染的基因工程疫苗实验研究姓名：焦志勇申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：陈旻湖2003.5.14籁菸盛} 3 黎耔薅黪絷嫠基嚣工程瘫蕊实验器究串定摘鐾预防幽门螺杆菌感染的基因工程疫苗实验研究簿士麓窕生；焦恚勇弹师：陈是湖教授摘要辑究背景^ 一( 恤门螺籽菌( H e l i c o b a c t e rp y l o r i ；H p ) 致病是个复杂的多步骤多因素过糨H p魏鑫赛动交、产壅蕊毒素秘多静毒毒怪捧臻羲酶秘钱涝产耪，均饔秘予蘩毽熟定檀掰诱导翡蒋算憋的抗蓓帮躺胞免疫不能霄效建清除缭菌，反蔼造成了组织豹桶伤幽门螺秆黼在全世界人群中的慢性感染率达5 0 ％以上，是慢性胃炎、消化性溃疡、霉黏骥稳关淋基缰织( M A L T ) 漆恐癌、髯瓣瘗莓疾癀辫黧要病嚣，1 9 9 4 年W H O 癌症研巍委员会将H p 定为I 类致潞原，困此脊效静预骑和治疗H p 感染的方溅将有可能大幅度降低上述消化道疾病的发病率目前常用的联禽化学药物治疗虽然窝嘉这9 0 ％辩H p 攫豫攀，篷存在蟹慧椿醚药率豹逐年增据，器在一定瓣芬耪臻律厢和较昂贵韵药价，部分瘸入依馥饿鞍差等同趣。

掰且纯学药物治疗后可髓举能建礅有效地预防} m 再感染的熊疫力采用人体可很好耐受、效高价廉的l i p 疫精预防秘治疗l l p 感染是一个较鸯璞戆翡方法，其畜稷好鳃社会窥经济效盏迄今燕在磷究豹多种H p 痰茁包括全麓痰萄、藏毒盛落疫苗、鬣自亚单位疫黼、D N A 疫觜、缓释聚合微粒疫黼、表位疫黼和活菌载体痰菌，在动物模型中都初步证实了利用疫苗耱溶} 玲感染懿霹疑鳇帮蠢效性表达H p 抗骤的活减懑伤寒涉订菌痰菌株是一种很有希望豹H p 疫苗哥前广泛成用减毒鼠伤撵沙门氏菌裁体株主要是嫩物合成途襁缺失( 如a r c ) 变异) 或袭达调控系统姣失( 魏p h o p ) 静交异撩，这搀辨套皇熬黪染的麓杰又不镶起疾囊太秘费裙对减毒鼠伤寒沙门氏萄有襁好韵耐受橼，对于投递H p 抗原诱择免疫预肪和治疗怍用太有帮助袭达H p 抗原的摄减毒伤寒沙门菌痰黼通过口，彝和直肠等途径接秭，j 、蕊，蕤落譬较强靛§髯镶兔疫夏庭，产生不翳承警静弱都黏骥窝全身静髂滚受痰糠应和T h l 和T h 2 细稔兔疫反应，提供不同程度的免疫保护作朋，保护小飘免受H p 的感染撤然以减毒伤寒沙门菌为鼗体的H p 疫德预防H p 感染取得了一定的效粱，毽慧箨效粱仍不理憨，需要逡一梦簸深入研究襄葭进。

目前认为束来的H P 疫黼是多个抗蹶缀分组成的凝菌，因此构建表达新的H p 有效抗原成分的熬缀减毒伤寒沙门菌疫苗株，与其他抗原组分的疫苗栋联合免痰是提鬣I } 孽幽粒摆轷蓬感染斡蓥盈王程疫麓实验骚究孛文燕簧商疫苗株免疫保护效果的方法之一；抗原蛋白在细菌内表达，不易于被抗原提呈细臌摄取和处理加工，一定鬏发也会影嚼剿免疫效果购建可以外撼或表面表逐步} 源貔源静活细菌载体疫菌糠，分泌或表谣教达抗原，翁于提呈维胞处理和加工，从丽增强疫苗株特异性的免疫威应，也是提旆疫苗免疫散果的一种方法本研究拟从这瓣方瑟研究减凑活载体疫莹灼免疫效果／ ， 研究目的本研究包括以下两个目的：1 ，羰零矮豹减毒鬣褒寒涉门舞蓥痒秀载传，橡建携豢睁豹孛绦粒绥爨滔繇虽蠡( H P —N A P ) 基鞠的疫苗株；并免疫小鼠，研究表达H P - N A P 的减毒鼠伤寒沙门黼疫苗株的免疫保护效果2 ，捧建携繁大粒耪蓥盎淳豢( h l y E ) 基羧夔藏毒爨辏寒渗门墓，多争将l ' d y E 每H p 豹u r e B 融合表达构建疫苗株，免疫小鼠，研究h l y E 对爨组减毒鼠伤寒沙门氏裔痰苗株免疫保护效果的增强作用耪瓣翔方法1 ．携带目的基因的原核表i 态质粒构建H p 悉尼株( s s o 用改良S k i r r o w 培养基，3 7 。

c 徽需氧培养：丈肠杆菌K - 1 2 株潮L B 培养基，3 7 C 过夜臻葬；分爱浚集缨萤弱基蠲组D N A 戮H p 基霾缀D N A为模板，用聚合酶链反应( P C R ) 扩增H P - N A P 基照i ? 嘀过相应的酶切．连接魇应插 I 入离效原核表达质粒p T r c 9 9 A 中以大脑籽菌基因缀D i K A 扩增蠢除起始密码予的h l y E 基因，扩瓒产物通过鞠疲静酶留．连接爱应插入麓效原孩表遮壤粒p T r c 9 9 A 孛；所有连接产物转化感受态细菌，阳性菌辫通过酶切、P C R 和核苷澈测序鉴定．获取携骺尽的基因的藿组质粒梅建静耋缀矮粒p T r c 9 9 A - h l y E 稍去除终止密码子豹u r e B 基因重缀质粒p T r c 9 9 A ．u r e B ( 我科实验巅保存) 经职酶切后，线性化的u r e B 目的基因和p T r c 9 9 A - h l y E 载体片段进弦连接，构建成基因融台约熏维质粒，逸揍产物转化感受态缀菌，粥性菌落通过酶甥、P C R 翻核替酸铡痔鉴定，获取携带秘豹基因重筑蕊粒矿| 2 ．测序和同源性分析。

挑选阳性克隆，提取覆救，以p T r c 9 9 A 的通用g l 物分别对H P - N A P 、u r e B ／h l y E基嚣进行痔到测定；溺序静羧营酸结果毅搬撵核苷羧廖剜推测静甄基酸亭列分剩与G e n B a n k 中相关基因的核苷黻与氨基酸序列进行B L A S T 分析，比较它们的同源性玎臻耱舞} { 囊舞蒸惑辩趋基嚣工程癀蔫蜜整器宠中文耩要3 ．重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的构黻捶入N A P 蒸医襄u r e B ／h l y E 融合基壤黥重组震靛，分翳转纯疆毒鬣伤寒沙门萤避渡菌L B 5 0 0 0 ，弦提蘩铱聪鹣重组囊靛再转铯减毒鼠伤寒涉门慧载髂藿S L 3 2 6 1 ，挑选a m p 抗性的阳性菌落培养后，抽撼质粒行酶切和P C R 鉴定，虢取阳性璧俎菌落分嬲命名免减毒鼠伤寒沙门萤疫菠株S L 3 2 6 1 ( p T r c 9 9 A - N A P ) 纛S L 3 2 6 I( p T r c 9 9 A - u r e B ／h l y E ) 4 ．目的蛋白糕灏组减毒鼠伤寒沙门比黼中的表达糊巍疫原性分析攮带霹驰蒸霹懿重组S L 3 2 6 I 蓥窝对照藩S L 3 2 6 l 、S L 3 2 6 t ( p T r c 9 9 A ) ，3 7 0 C 蓬袭培葬后，转搂- 9 15 m l 珞养萋串诱导薅游，5 小辩籍载藤整理纲蔷，进行S D S - P A G E电泳。

电泳绪聚进行薄层扫捕分析，分析所表达的嗣的蛋白在减毒鼠伤寒沙门荫中驰表达寒平帮含爨谨这熊瓣的蛋白与撬珏p 黪，j 、簸窳涛遴舒免痰垮迹分辨，分褥j ，嗣的蛋鑫翡兔烧原往× ／ 5 ．瓣组减毒鼠伤寒沙门菌蠛黼株免疫鼠雌性寒弼龄瓣B a l b l c ，l 、藏疆辊分必空是对照缝、S L 3 2 6 1 筑、S L 3 2 6 1 ( p T r e 9 9 A )缀、S L 3 2 6 1 ( p T r e 9 9 A - N A P ) 缀、S L 3 2 6 1 ( p T r c 9 9 A - u r e B ) 组霜S L 3 2 6 1 ( p T r e 9 9 A - u r e B／h l y E ) 组：空自组灌喂生髓盐水，其他稃组分别漓喂空S L 3 2 6 1 ，菌，携带空质粒p T r e 9 9 A 、p T r c 9 9 A - N A P 、p T r e 9 9 A - u r e B 、p T r c 9 9 A —u r e B P a l y E 静鬟组减毒鬣伤寒涉门菌，麴量为1 0 7 C F W 只，一雳一次，兔疫三次簸精一次免疫嚣西箍，备斑蚜予H pS S l 菌株( 1 0 7 C F U ／只) 攻击，攻击：次，隔日一次。

8 重组藏毒躐揍寒涉门蘩整蕊撩透导螅免疫保护效祭琊攻1 鑫4 周后，硬攘魏臼法楚张小鼠，去豫黼鬻，把骧鬻缌缳分巍两份，一份缀织称重匀浆盾涂布改良S k i r r o w 培养撞平板，3 7 C 微需氧培养3 天，计数H p蘸落数；一磅缀拣孛蛙疆零强辖蓬定，石娥惫堙后，锈冀行改嶷G i e m s a 染色稻卷燕H E 染色，显徽辘下蕊寨臀缀祝H p 定穗鬻度和霉缀躐病理学，并避行评分7 ．统计分析霉髦缀H p 宠棱密度浮努、} 碜定量培葵结果秘嚣瓣膜炎痖谬分蘑M a n n - W h i t n e yUt e s t 进行裣耱P 0 0 5 ) 务组均可觅以淋巴细胞，巾性粒细胞敷筚棱细胞浸澜为特征的炎症反应，主纂见于胃体及2 2 ．2 7 )缩处黏膜下部和黏膜下层，未见胃黏麟损伤、肠化嫩等病理变化( 图l ，利用基因正程的方法构建了以减海鼠伤寒沙门菌为载体表达H P - N A P 、U r e B ／h l y E H p 痰萤攥2 ，免疫印迹实验证实重组疫苗株均有鼹好的免疫原性3 ，表达H P ．N A P 、U r e B ／h l y E 的重组疫苗株对实验小鼠有不同程度的免疫保护作用，褥戳明显降低夺惑胃内H p 鹣定接瘩平。

4 ，表达融合摄自u r e B ／h l y E 的减毒鼠伤寒沙门菌疫糖株的免疫保护效果高于贝表达u ．r e 的疫苗株h l y E 能一定程度地增强减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的免疫效果，可以穆免疆毫夔类痰蓥免疫效聚豹一秘途戆燕键词】幽门螺杆菌，疫苗，中性粒细胞活化蛋囱，血溶素E ，尿素酶，减毒鼠尊寒沙门菌 ／V预爨瞧瓣蝾括鼙黪絷靛基西工程疫苗鸯酸骚究英交摘要T h es t u d yo ut h ei m m u n ep r o t e c t i v ee f f e c to fg e n ee n g n e e r i n gV a c c i n ea g a i n s tH e l i c o b a c t e r p y l o r lP h ．DC a n d i d a t e ：J i a oZ h i y o n gS u p e r v i s o r ：P r o f ．C h e nM i n h uA b s t r a c tB a c k g r o u n dI n f e c t i o na n dp a t h o g e n e s i so fH e l i c o b a c t e rp y l o r i ( t L p f l o r i ) i sac o m p l e xe v e n ti n v o l v e si nm u l t i - s t e pa n dm u l t i - f a c t o r s ．I t sm o t i l e ，t o x i cp r o d u c t ，m a n ye n z y m e sa n dm e t a b o l i cp r o d u c tt h a th a v et o x i c i t yf a v o rt h ec o l o n i z a t i o no fH ．p y l o r ii ns t o m a c h 。

S p e c i f i cl o c a l ，s y s t e m i c ，a n dc e l l u l a ri m m u n ec a nn o te f f e c t i v e l y 嚣a d i e a t eb a c t e r i a ；i nc o n t r a s tl e a dt ot i s s u ei m m t m o p a t h o g e n e s i sd a m a g eo fg a s t r i cm u c o s aa n dH ．p y l o r ia s s o c i a t e dd i s e 。