正相硅胶-选择洗脱气相色谱法、液相色谱质谱法检测.doc

1正相硅胶/ 选择洗脱 气相色谱法、液相色谱 质谱法检测作者：张金虎 林永辉 梁震 ,刘建军【摘要 】 以正相硅胶/选择洗脱为核心，建立了一种适用于各种复杂基质食品中甲胺磷残留分析的前处理方法样品用无水Na2SO4 配合乙酸乙酯均质研磨，超声波辅助提取，提取液经 PSA粉末分散固相萃取和 LC Si 柱单一溶剂选择洗脱净化后，供气相色谱仪(GC)和超高效液相色谱  串联质谱仪(UPLC MS/MS) 分析气相色谱采用火焰光度检测器(FPD)，液相色谱  质谱联用采用电喷雾正离子方式(ESI+)，T3 键合技术(HSS T3)和亲水作用(HILIC)超高效液相色谱柱分离，外标法定量方法简便、快速，通过优化前处理和上机条件，在最优条件下进行测试，气相色谱法、液相色谱  质谱联用法的定量下限(S/N≥10)为 0.0007～ 0.006 mg/kg，回收率分别为 73%～90%， 81%～96%，相对标准偏差分别为2.4%～6.1%， 5.2%～10.8%并对选择洗脱净化过程中的作用机理进行了研究 【关键词】 气相色谱法，超高效液相色谱  串联质谱法，T3 键合技术色谱，残留分析，甲胺磷21 引 言甲胺磷(Methamidophos)，是一种高效、广谱性有机磷杀虫剂和杀螨剂，曾是我国生产和使用量最大的农药[1]，虽然国家于2007 年禁止其销售和使用，但违规现象屡禁不止，甲胺磷残留超标及食物中毒事件时有发生，使得检测甲胺磷残留问题成为人们关注的焦点。

但甲胺磷残留检测技术一直被认为是农药残留检测技术中的难点之一，样品基质的复杂化程度直接影响到实验结果及成败[1～6]通过选择对干扰物质无响应的检测器，可以在一定程度上解决基质干扰的问题但各种检测器都有它的弱点：FPD 检测器在检测含硫基干扰物质(葱、蒜等) 和加工过程中使用类似物质处理过的样品(干香菇等 )时干扰严重，无法进行定性与定量分析;NPD 检测器对自然界中普遍存在的含氮化合物有响应，结果易受干扰，而且响应值低、峰形拖尾严重，定性与定量分析困难;MS 检测器检测甲胺磷时，由于保留时间短，所监测离子的分子量小，易受干扰，信噪比较低，分析复杂基质样品时信噪比很差，无法满足要求而且，气相色谱检测时需要在衬管中气化，甲胺磷对衬管的洁净程度极其敏感近年来，液相色谱  质谱联用被用于检测甲胺磷，样品无需加热，不会分解，也不涉及衬管吸附，具有一定的优势但在检测复杂基质样品[3]时，由于甲胺磷在普通反相色谱柱上基本无保留，3大量共流出的杂质产生了严重的离子抑制(基质效应)，甚至无响应提高前处理的净化效果才是彻底解决甲胺磷问题的办法本实验建立了一种甲胺磷残留分析的前处理新方法，选择各种复杂基质样品(黑胡椒粉、茶叶、干香菇、小麦、蒜、韭菜、姜、葱、烤鳗及黄鱼)及有代表性样品( 菠菜、苹果)进行验证。

由于食品中硫基干扰物质与农药性质极其相似，目前尚没有办法在前处理阶段将它们除去[7,8]，必须在制样时用微波或磷酸对样品进行处理，在实际检测中难以操作本方法实现了农药与硫基干扰物质在前处理的分离，使葱蒜类样品中的甲胺磷残留检测在 GC FPD 上也能得到无干扰的色谱图另外，本方法实现了各种不同基质样品中甲胺磷残留检测方法的统一本方法将 1.8 μm 填料的 T3 键合技术 HSS T3、1.7 μm 填料的亲水作用 Hilic 超高效液相色谱柱配合电喷雾串联质谱用于有机磷农药检测，解决了普通反相色谱柱死时间问题，关于有机磷农药在这两种新型液相色谱柱上的色谱行为尚未见文献报道实验发现甲胺磷在 LC Si 固相萃取小柱上能够实现单一溶剂选择洗脱的现象，本实验对净化过程的作用机理进行了研究2 实验部分42.1 仪器与试剂7890A 气相色谱仪，FPD 检测器，HP 5 毛细管柱(30 m×0.32 mm， 0.25 μm， 美国 Agilent 公司);Waters Quattro Premier 超高效液相色谱  串联四极杆质谱仪，ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm， 1.8 μm)， ACQUITY UPLC Hilic(50 mm×2.1 mm， 1.7 μm)超高效液相色谱柱 (美国 Waters 公司);T 18basic 均质器(德国 IKA 公司);低速离心机( 德国 Sigma 公司); 旋转蒸发仪(德国 Heidolph 公司);DC 12 氮吹仪(上海安谱公司); 标准品(德国 DR 公司);PSA 粉末、LC Si 固相萃取小柱 500 mg/6 mL(美国 Supelco 公司 );所用试剂均为分析纯或色谱纯;实验用水为三重过滤去离子水。

2.2 实验方法2.2.1 样品提取 (1)新鲜样品 称取匀浆样品 2 g 至 50 mL 离心管中，加入乙酸乙酯 20 mL，无水 Na2SO4 8 g，用均质机15000 r/min 均质 1 min，10 mL 乙酸乙酯清洗均质头，合并溶剂，4000 r/min 离心 5 min，上清液过无水 Na2SO4(约 20 g)层滤入150 mL 鸡心瓶，残渣中再加入乙酸乙酯 20 mL，捣碎，涡旋振荡1 min，超声波提取 10 min，期间取出振摇 2 次，4000 r/min 离5心 5 min，合并提取液至鸡心瓶中，40 ℃减压旋转蒸发至近干，待净化2)干制品 称取粉碎样品 0.5 g 至 50 mL 离心管中，加入2～3 mL 水，涡旋润湿，静置 2 h 以上，以下步骤同新鲜样品分 析 化 学第 37 卷第 10 期苏建峰等：正相硅胶 /选择洗脱气相色谱法、液相色谱  质谱法检测食品中甲胺磷残留及其作用机理研究 2.2.2 样品净化 PSA 分散固相萃取净化：在鸡心瓶中加入3 mL V(丙酮)∶V(正己烷 )=1∶1 溶剂，超声波清洗 10 s，再加入0.5 g 活化过的 PSA 粉末，涡旋振荡 30 s，静置 15 s，倾斜鸡心瓶，用吸管小心吸取上清液(只吸出约 2 mL，注意不能将粉末吸入)至10 mL0 玻璃管中，再用 2 mL V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶1 溶剂洗粉末 2 次，合并提取液(约 6 mL)，在 40 ℃用氮气吹干，待过柱净化(基质较为简单的样品可省略本步骤，直接进入下一步)。

LC Si 柱选择洗脱净化：将 LC Si 柱置于 15 mL 玻璃管上，在柱上装入 1 cm 高无水 Na2SO4，用 5 mL 乙酸乙酯活化，再用3×1 mL 乙酸乙酯涡旋洗玻璃管，过柱，液面到达无水 Na2SO4 顶端后继续用乙酸乙酯淋洗，自然流速，弃去前 9 mL 洗脱液，再收集 14 mL 洗脱液，在 40 ℃用氮气吹干，以 V(丙酮)∶V( 正己烷)=1∶1 溶剂定容至 1 mL 供 GC 测试;以 10%甲醇水溶液定容至 5 mL 供 UPLC MS/MS 测试62.2.3 色谱  质谱条件 气相色谱条件：载气为氮气(99.999%) ，流速 2.0 mL/min，尾吹流量 60 mL/min; 氢气(99.999%)流量 75 mL/min;空气流量 100 mL/min进样口温度 220 ℃，进样量 2 μL，不分流进样，检测器温度 250 ℃柱温程序：60 ℃(2 min) 15 ℃/min160 ℃ 30 ℃/min280 ℃(3 min)超高效液相色谱  串联质谱条件：流动相 A 为水，流动相 B为甲醇梯度洗脱：0～1.8 min，90%A;1.8～2.0 min，90%～10%A ，保持 0.5 min;2.5～3.0 min，10%～90% A，保持 0.5 min。

流速 0.2 mL/min， 柱温 30 ℃， 进样量 5 μL 离子源： 电喷雾 (ESI+)， 毛细管电压：1 kV，锥孔电压：25 V，碰撞电压： 15 V，二级锥孔电压：3 V，透镜电压：0.3 V，源温度：110 ℃，脱溶剂气温度：350 ℃，脱溶剂气流量：800 L/h，锥孔气流量： 50 L/h，光电倍增管电压： 650 V定量离子对 m/z 142/94，定性离子对 m/z 142/125驻留时间：100 ms3 结果与讨论3.1 样品前处理条件的选择3.1.1 提取 乙酸乙酯极性较强，能有效地将食品中的甲胺磷提取出来，且样品基质中的共提取杂质相对较少;使用乙腈[9]提取时7共提取杂质稍多使用无水 Na2SO4 一方面配合均质器研磨，增加分散的均匀度，加强溶剂与样品的接触，提高提取效率，另一方面可以将样品中的水分以结晶水的方式除去，既不对甲胺磷产生吸附，又避免甲胺磷溶于水导致回收率的损失配合超声波辅助提取，进一步提高提取效率实验时需先加乙酸乙酯后加无水 Na2SO4，以免无水 Na2SO4 结块导致均质困难由于本实验对水分的残留较为敏感，提取时要尽可能将水分除干净，否则影响到 PSA 填料的吸附性能，净化效果变差;影响到 LC Si 柱的吸附性能，可能改变柱上的洗脱规律，甚至导致实验的失败。

可将无水 Na2SO4 在 650 ℃焙烧约 4 h 后备用，必要时增加用量3.1.2 净化 PSA 材料的硅胶表面键合有极性官能团，能从样品中吸附极性化合物，对于样品中的一些强极性杂质、有机酸、色素、金属离子及糖等具有良好的净化效果[10]本实验中，分散固相萃取净化不是必需的步骤，常规蔬菜、水果、新鲜动物性产品等均可省略此步骤，具体步骤为：提取液浓缩近干后加入 3×1 mL 乙酸乙酯涡旋洗鸡心瓶，直接过柱即可，回收率提高约 10%但某些基质样品如葱蒜、干香菇、茶叶等必须采用此步骤先除去大部分的强极性杂质，以免 LC Si 柱吸附饱和影响实验效果，弱极性杂质则无影响，这主要是因为使用乙酸乙酯淋洗时弱极性杂质基本无保留地通过了柱子8LC Si 柱的硅胶表面含有大量的硅羟基，能够吸附极性化合物，通过调变适当的淋洗液和洗脱液，可以达到吸附特定化合物或杂质的目的甲胺磷在乙酸乙酯介质中与硅羟基反复发生吸附与解吸附过程(详见作用机理分析) ，3 mL 提取液过柱时，当液面到达无水 Na2SO4 顶端后才能继续加入乙酸乙酯，以免形成涡流影响整体洗脱效果，过程中需保持溶剂浸润柱填料，不能干涸，以免柱中产生气泡或强吸附点使洗脱规律发生变化。

在本实验条件下，绝大部分甲胺磷在第 10～22 mL 流出，实验收集第 9～23 mL 流出液，很好地实现了甲胺磷和杂质的分离，包括葱蒜类样品中的挥发性硫化物其中：弱极性杂质如油脂等大部分在 2 mL 左右就流出柱子，随后大量色素、酚类杂质开始流出，接着一些中强极性的杂质也被乙酸乙酯洗脱出来，大部分中强极性及偏弱极性的杂质都在 7 mL以前流出，而强极性杂质则被吸附在柱填料上，能与甲胺磷共流出的杂质量非常少，除茶叶样品有时会略带淡黄色外，其余均为无色透明液体3.2 仪器条件的优化3.2.1 气相色谱条件优化 气相色谱检测甲胺磷，衬管和色谱柱前端的维护比较关键，甲胺磷对衬管的洁净程度极其敏感，新衬管内壁存在活性点，气化时会吸附甲胺磷测试加标样品时，由于样品中的基质可能优先占据活性点，吸附减少，表现出基质增强效9应; 如果衬管或样品中的杂质太多，基质中的活性点也会对甲胺磷形成吸附，表现出吸附减弱效应;如杂质含量过多，甚至无信号检出原有的前处理方法在处理复杂基质样品时无法将样品净化干净，影响上机测试，结果不稳定，再加上谱图干扰，无法进行定性与定量分析色谱柱前端的污染也有类似现象本实验在实际测试前先注射适量实际样品溶液和高浓度的甲胺磷标液(约 1 mg/L)，使衬管先行饱和[11] ，以减少衬管对后续样品的吸附，取得了良好的效果。

各种食品基质加标样品的 GC FPD 色谱图见图 1图 1 中蒜头样品有一些杂质峰，这些杂质峰是挥发性硫化物所产生的信号虽然葱、韭菜样品也含有挥发性硫化物，但其色谱图中却没有杂。