神经管发育与神经干细胞.ppt

神经发育与神经干细胞◆神经系统形态发生机制◆神经系统形态发生◆神经干细胞及其功能出生前大脑发育出生后大脑发育神经管形成机制前-后轴图式形成机制背-腹轴图式形成机制神经细胞亚型特化机制突触形成机制神经干细胞定义及特征神经干细胞分类及分布神经干细胞来源干细胞概念及研究现状神经干细胞应用前景神经系统形态发生出生前大脑发育出生后大脑发育出生前发育概貌 卵子+精子 合子 合子着床 胚胎 8周至出生 胎儿随着发育的进行，沟回开始出现人胎儿大脑发育侧面观 神经系统构建模式图–神经板诱导–神经细胞增殖–迁移与聚集–轴突生长与突触形成–细胞死亡与突触重排a.￿由三层细胞组成:￿内胚层，中胚层，外胚层外胚层的增厚导致神经板的发育￿b.￿第20天时神经沟开始发育怀孕的第18天胚胎开始种植于子宫壁1.￿神经板的诱导c.￿第22天神经沟沿着胚胎体长方向闭合，产生神经管d.￿随后，可见大脑的四个主要部分：端脑￿(telencephalon)间脑￿(diencephalon)中脑￿(mesencephalon)后脑￿(rhombencephalon)2.￿神经细胞有丝分裂/增殖￿增殖—产生新细胞在室区开始速度达到250,000/min神经上皮细胞有丝分裂周期有一个在神经管壁内往返迁移的过程。

分裂期（M期）的细胞紧靠管壁，分裂后的细胞离开管壁向外移动，同时向内外两侧伸出细胞质突起，为G1期随着细胞逐渐移向神经管壁外表面，细胞进入DNA合成的S期此后细胞又逐渐向内移动，在接近管壁时进入G2期当靠近管壁时，细胞质突起缩回，细胞重又进入M期在细胞分裂后又向外移动，开始新一个细胞周期这个过程直到细胞终止增殖，开始迁移为止增殖神经细胞增殖特点在胚胎发生过程中，前体细胞增殖的细胞周期在不断延长小鼠大脑皮质前体细胞细胞周期从胚胎期的第10天到第17天不断延长这种延长大部分是由于G1期的时程增加引起的，几乎能增加3倍.神经细胞增殖——细胞周期特点★★Radial glial cells act as guide wires for the migration of neuronsMigrating cells are immature, lacking dendritesCells that are done migrating align themselves with others cells and form structures (Aggregation)★★slow movement to the “right place”3.￿迁￿移4.轴突生长与突触形成 为了正确地执行传递和加工信息的功能，神经系统依赖神经元之间和神经元与外围的靶器官之间形成高度特异的相互连接。

显然，这种高度特异的连接要求在发育期间一种高度精密的控制在发育初期，神经元完成了它们的组织形态发生和迁移到其合适的位置后，它们还需精制它们的轴突和树突，并形成二者及其与其他非神经细胞之间的连接，以执行其功能￿神经连接的形成包括：轴突生长、突触形成An axon growing to its target like a driver navigating through city streets .轴突的生长神经突起从细胞体的什么地方出现和形成突起的数目是由该细胞本身固有的因子决定的环境因素引导突起的向性生长轴突的长出，选择合适的路径到达正确的靶细胞神经蛋白聚糖诱导神经递质受体成簇突触基板形成突触形成：突触形成：神经元与其靶细胞间的功能连接点称为突触突触的形成包括三个重要过程：轴突与其靶位有选择的建立联系、生长锥分化为神经末梢以及突触后细胞结构的完善突触囊泡在神经末梢聚集，突触间隙处形成基底层随着肌纤维成熟，许多轴突在一处聚合除去不正确和多余的轴突，最后只有一个轴突发育成熟，其余死亡5.神经元细胞死亡40-75%神经元迁移后将死亡—死亡是正常且必须的!!神经元的死亡是因为竞争靶目标提供的化学物质失败。

神经营养因子￿–￿–促进生长和生存–引导轴突生长￿–刺激轴突发生神经管的分化在3个水平上同时进行：￿￿￿￿◆在解剖学水平，神经管及其管腔经膨胀和收缩，形成脑￿￿￿￿￿￿室和脊髓的中央管；￿￿￿￿◆在组织学水平，神经管壁细胞发生重组，形成脑和脊髓￿￿￿￿￿￿不同的功能区域；￿￿￿￿◆在细胞水平，神经上皮细胞本身分化成身体中不同类型￿￿￿￿￿￿的神经元和神经胶质细胞二.￿出生后大脑发育￿￿￿￿出生后生长是以下事件发生的结果–突触发生–不断增加的树突分枝–髓鞘形成￿￿￿￿阶段年龄阶段重要事件出生前出生前怀怀孕孕 – 出生出生快速生快速生长长婴婴儿儿 出生出生 - 2 周周岁岁运运动发动发育育童年童年2 - 12 周周岁岁抽象推理抽象推理青春期青春期13 - 20 周周岁岁判断、判断、创创造造使前额叶皮层日益成熟是与年龄有关的认知功能，判断，决策，决策的变化的基础第二部分：神经系统形态发生机制1.￿神经管形成机制2.￿前-后轴图式形成机制3.￿背-腹轴图式形成机制4.￿神经细胞亚型特化机制5.￿突触形成机制6.￿神经元程序化的细胞死亡胚胎细胞发育命运的两种作用方式★胞质隔离(cytoplasmic￿segregation)：卵裂时，受精卵内特定的细胞质分离到特定的裂球中；裂球中所含有的特定胞质可以决定它发育成哪一类细胞，而与邻近细胞没有关系。

细胞发育命运的这种定型方式称为自主特化（autonomous￿specification）★胚胎诱导(embryonic￿induction)：胚胎发育过程中，相邻细胞或组织之间通过相互作用，决定其中一方或双方细胞的分化细胞发育命运的这种定型方式称为有条件特化或渐近化(conditional￿specification)★Neuralization信号：起神经化外胚层细胞的作用，致使它们成为神经细胞而不是皮肤细胞；★Patterning信号：将神经化的外胚层细胞进一步图式化，使处在不同亚区的神经化外胚层细胞作出决定，成为脑型或脊髓型的神经细胞原肠期的胚胎细胞是否向神经谱系分化由三条信息轴决定!神经前驱细胞命运由两组信号控制卵子中存在位置信息(胞质决定子)，其中一些母源性RNA在卵子中不是均匀分布的动植物极轴——卵子在发育成熟过程中形成背腹轴——精子进入位置决定该轴形成前后轴——受精引起皮质震荡形成该轴三条信息轴位置关系 ￿￿Spemann￿&￿Mangold￿(1924)取蝾螈原肠胚的胚孔背唇(红色)移植至另一品种带色素的蝾螈原肠胚的胚孔对侧 部 位 ， 结 果 移 植 块 将 带 色 素 的 寄 主 组 织 诱 导（Induction）出新的含神经管和体节的体轴。

他们将具主导组织者功能的背唇区称作Spemann￿organizer 实验证明胚孔的背唇为诱导者（inducer或organizer￿）1.￿神经管形成机制在有机体的发育过程中，一个区域的组织与另一个区域的组织相互作用，引起后一种组织分化方向上的变化的过程称为胚胎诱导（embryonic￿induction）组织者的活化因子：1）Noggin（头素）：是组织者分泌蛋白之一完成Spemann组织者的两种主要功能：a，从预定外胚层诱导神经组织b，使中胚层背方化它同BMP4直接相互作用，阻止BMP与其受体结合2）Chordin（脊索素）:￿使胚胎背方化和诱导神经生成与Norggin一起抑制BMP的信号,阻止中胚层腹方化.3）Follistatin（卵泡抑素）:￿通过结合活化素，解除后者对神经化的抑制作用，使外胚层神经化还可以结合BMP7，通过抑制BMP7阻止中胚层腹方化.BMP7是激活BMP4所必需的.以上三者都是通过抑制BMP4的活性而诱导神经化形成2.￿脊髓背-腹轴的图式形成脊索与基板表达Sonic￿hedgehog￿，而顶板表达BMP这两种分泌性因子形成两个相反的梯度浓度，调节图式化基因的表达。

不同区域化表达不同的图式化基因产物组合，从而确立了不同背-腹轴位置神经细胞的分化命运中胚层提供的“转化信号”：bFGF（（basic fiboblast growth factor））视黄酸类物质视黄酸类物质(retinoids)Wnt3.￿中枢神经系统前-后轴的图式形成神经组织在最初被诱导形成时，整个神经板细胞都只表达“前部”神经特异性基因在原肠作用过程中，由后部中胚层产生的后部化因子￿(Wnt,￿FGF,￿视黄酸等)由后向前形成一个浓度梯度，调节图式化基因表达前后脑的界限是由Pax6与Pax2的表达区域决定的，而中脑与后脑的分界位于Otx2与Gbx1的表达界线处Hox基因的区域性表达进一步确定后脑与脊髓的区域分化位于前脑最前端的前神经褶（anterior￿neural￿ridge，ANR）表达FGF8，对于前脑的图式形成具有重要作用峡部（isthmus）是位于中脑与后脑交界处的狭窄部峡部在中后脑的前-后轴图式形成中起着重要作用4.神经元亚型特化机制￿￿￿￿在脊髓背-腹轴的不同水平表达不同的图式化基因组合，这些图式化基因进而决定着相应位置所产生的神经元类型随后，在不同背-腹轴区域表达一组原神经基因（proneural￿gene）。

★抑制其周围细胞向神经元分化★促进细胞向神经元方向分化而抑制其分化为神经胶质细胞★调节细胞周期★参与活化神经细胞亚型特化所需基因表达在背腹轴（D-V￿axis）的一些图式化事件也发生在与之正交的前后轴（A-P￿axis）的类似复杂神经管图式化过程中前后轴图式化的信号与背腹轴图式化信号正交成笛卡尔坐标系，两轴的各个正交叉点上的NECs表达的一些转录因子组成独特密码（code），由它决定处在这些正交点上各自细胞的命运轴突和树突生长的末端被称为生长锥（growth￿cone），它是一种高度能动的细胞结构特化的形式：呈薄的扁平膜状，伸几个细的丝状伪足作为其延长部分在生长锥中含有许多小泡，可能是新合成的膜生长锥好像用其丝状伪足探索它周围的细胞环境当遇到不利情况时，它缩回；当遇到有利地带时，它保留下来，而轴突将沿这个地带生长1.Lamellipodium幔状伪足2.Filopodium￿指状伪足5.突触形成机制FIGURE 5.20 Short-range (or contact) and long-range attractant and repellents guide an axon. This axon is pushed from the left and pulled from the right by long-range cues, while hemmed in along a narrow pathway by contact adhesive and repulsive cues. 四种导向机制四种导向机制：：接触吸引接触抑制化学吸引化学抑制短程信号远程信号轴突生长的导向神经末梢感受信号Cell￿adhesion￿molecules(CAMs)1.Laminin +2.fibronectin +3.Tenascin - +Extracellular matrx N-CAMs Fasciculins NetrinsIg CAMssemaphorin引导轴突生长的分子：短程信号细胞黏附分子细胞外基质Immunoglobulin(Ig) superfamily免疫球蛋白超家族Cadherin钙粘着蛋白家族Integrins(15,8 chains)整合素家族蛋白酪氨酸激酶及蛋白磷酸酶受体和配体RPTKs，RPTPsEph家族short￿-range￿cuesNetrins 糖蛋白Semaphorins脑信号蛋白Neurotrophic factors 1.neurotrophins 2.growth factors3.cytokines 引导轴突生长的分子：远程信号long￿-range￿cues神经生长因子定向诱导轴突的生长方向，当微量吸管改变方向后，轴突随之重新定向它的生长方向。

生长锥的趋药性FIGURE 5.27 Growth cone collapse. A time-lapse series of agrowth cone from a retinal ganglion cell encountering an axon of asympathetic axon in culture. Upon first contact, the growth coneretracts and collapses.排斥性引导6.神经元程序化的细胞死亡 ￿￿￿￿在任何已知的脑区中，神经元的总数是明显固定不变的显然，神经元的数目被精确地调整着即使在神经细胞增殖和迁移的阶段也是部分地被调整的虽然对在增殖和迁移阶段的调整机制还了解甚少，但像在许多其他的组织中一样，在神经系统中调整细胞数目的一种机制是程序化的细胞死亡，即自然发生的细胞凋亡（apoptosis）允许神经元生存或死亡的分子状态神经系统发育主要过程归纳为（1）诱导，包括对神经板形成的原发诱导及早期脑脊髓等形成的次发诱导；（2）增殖，包括对原发诱导的反应及作为神经系的某些特殊部分的形态发育和生长的开端；（3）神经元及神经胶质的分化，包括结构分化及功能成熟分化；（4）细胞的迁移；（5）细胞的联系及同类细胞的粘着；（6）神经元间的联系及细胞死亡；（7）细胞群落特殊联系的建立；（8）已建立联系的神经功能的发育。

一.神经轴的发育二.前-后轴形成机制三.神经管背腹发育分化四.神经元发生五.轴突生长BMPBMP活化信号活化信号转化信号转化信号CompartmentCompartmentShh(Sonic Hedgehog)BMPBMP旁抑制信号机制(Delta和Notch)生长锥￿Growth￿cones生长锥的前伸运动生长导向Wnt,FGFWnt,FGF，，RARA，，TGF-TGF- 第三部分：神经干细胞与脑功能再生1.神经干细胞定义及特征2.神经干细胞分类及体内分布3.神经干细胞体外分离培养4.神经干细胞来源及鉴定5.干细胞种类及体细胞重编程6.神经干细胞与胚胎干细胞7.神经干细胞应用前景1.￿神经干细胞的发现￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿1989￿1989年，年，TempleTemple等从等从1313天大鼠胚胎脑隔区取出细天大鼠胚胎脑隔区取出细胞进行培养，发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞进行培养，发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞其后从成年鼠纹状体、海马齿状回处分离出能在体胞其后从成年鼠纹状体、海马齿状回处分离出能在体外不断增殖，并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能外不断增殖，并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能的细胞群。

的细胞群Sally Temple. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature，，1989，，340, 471-473. (Okano et al. 2002)指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群1.神经干细胞定义neural￿stem￿cell，NSC神经干细胞是20世纪末神经生物学领域中最伟大发现之一，为人们攻克诸如老年性痴呆、帕金森病以及脊髓侧索硬化症等神经退行性疾病带来了新的前途和希望Where￿are￿neural￿stem￿cells?￿Shen et al. Cell stem Cell, 2009神经干细胞的特征★★增殖能力增殖能力★★自我更新能力自我更新能力★★多向分化潜能多向分化潜能★★迁移性迁移性★★可塑性可塑性bFGF、EGFBDNF、NT-3自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。

◆根据部位分类主要有两类：根据部位分类主要有两类：神经嵴干细胞神经嵴干细胞(neural￿crest￿stem￿cell(neural￿crest￿stem￿cell，，NC-SC)NC-SC)：既可发育：既可发育￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿为外周神经细胞、神经内分泌细胞和为外周神经细胞、神经内分泌细胞和SchwannSchwann￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿氏细胞，也能分化为色素细胞氏细胞，也能分化为色素细胞(pigmented￿cell)(pigmented￿cell)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿和平滑肌细胞等和平滑肌细胞等中枢神经干细胞中枢神经干细胞(CNS-NSC)(CNS-NSC)：一般是指存在于脑部的中枢：一般是指存在于脑部的中枢￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿神经干细胞神经干细胞(CNS-SC)(CNS-SC)，其子代细胞能分化成为，其子代细胞能分化成为￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿神经系统的大部分细胞。

神经系统的大部分细胞2.￿神经干细胞分类及体内分布◆根据神经系统发育时序分5类发育潜能的神经干细胞★神经上皮祖细胞（NEP）★放射状神经干细胞（R-NSCs）★神经元能神经干细胞（N-NSCs）★胶质细胞能神经干细胞（G-NSCs）★晚期神经干细胞（L-NSCs￿） 中枢神经系统发育起始于神经干细胞（NSCs），这个发育阶段称为神经诱导，受时空严密控制自神经板到成年脑组织，均可分离到具备不同发育潜能的神经干细胞各级神经干细胞的特征神经上皮祖细胞：多能性，致瘤性放射状神经干细胞：多能性，致瘤性神经元能神经干细胞：产生神经元，但不产生胶质细胞胶质细胞能神经干细胞：不仅能产生神经元，亦能产生胶质祖细胞晚期神经干细胞：神经元分化能力相对于前两者明显下降★胚胎期：　神经干细胞主要分布在大脑的皮层、纹状体、海马、室管膜下层和中脑等区域★成年期：　中枢神经系统仍有神经干细胞存在，这些细胞平时处于静止状态成年脑区神经干细胞主要局限在海马齿状回、纹状体和环绕侧脑室的室脑膜下层神经干细胞的分布3.￿神经干细胞体外分离与培养★神经球悬浮培养法★单层细胞贴壁培养法Journal of Neuroscience Methods 85 (1998) 141–152. 神经球悬浮培养法Clive￿N.￿Svendsen等采用机械切割法和酶消化相结合的方法，建立了可以长期传代的人神经干细胞系。

Mol. Cell. Neurosci. 38 (2008) 245–258单层细胞贴壁培养法2008年，Austin￿Smith￿等建立了单层贴壁法长期传代培养神经干细胞的方法神经干细胞的鉴定——Nestin19901990年，年，LendahlLendahl证实，神经干细胞的标志蛋白是神经上皮干细证实，神经干细胞的标志蛋白是神经上皮干细胞蛋白（胞蛋白（nestinnestin）．）．NestinNestin在神经胚形成时开始表达，随着神经细在神经胚形成时开始表达，随着神经细胞的迁移和分化的完成，胞的迁移和分化的完成，NestinNestin的表达量逐渐下降甚至完全停止的表达量逐渐下降甚至完全停止From our lab.Sakakibara等人鉴定出一种等人鉴定出一种RNARNA结合蛋白即结合蛋白即￿ ￿Musashi￿,Musashi￿,可作可作为为NSCNSC的标志物的标志物Sakakibara et al. 1996)E10E14Ventricular zone of spinal cord神经干细胞的鉴定——Musashi◆来源于神经组织◆来源于胚胎干细胞◆来源于血液系统干细胞◆来源于永生化细胞系◆来源于体细胞重编程4.￿神经干细胞的来源5.￿神经干细胞与胚胎干细胞关系￿当首次获得猴ES细胞（1995）、人ES细胞（1998、2000）、人EG细胞（1998）以及猴单性生殖的干细胞（pathenogenetic￿stem￿cells，2002），就很快发现它们具神经分化潜能。

￿￿￿￿￿因此，ES细胞已成为研究神经发育生物学和细胞区域专一性是如何建立等研究的有效模型系统而神经干细胞在其中起着桥梁的作用人ES细胞向神经干细胞分化具有其独特性，可用于研究脊椎动物中的D-V图式化人与小鼠ES细胞分化的一个有趣的差别是：在人ES细胞的神经分化的一些早期阶段中出现大量的玫瑰花结样的结构，可用这一结构研究脊椎动物的D-V图式化机制干细胞种类及体细胞重编程干细胞的分类★全能干细胞(totipotent)：受精卵及其早期卵裂球★多能干细胞(pluripotent)￿￿胚胎干细胞：内细胞团群细胞￿￿胚胎生殖细胞：原始生殖细胞￿￿体细胞核移植胚胎干细胞：卵子诱导体细胞重编程而来￿￿诱导的多能干细胞：转录因子诱导体细胞重编程而来★￿单能干细胞(unipotent)：成体干细胞，组织特异性干细胞￿￿￿￿￿￿￿全能干细胞：受精卵From our Lab.存在部位脑、￿骨髓、循环血、牙髓、脊髓、血管、骨骼肌、表皮、消化管上皮、角膜、视网膜、肝、胰、肾脏、脂肪组织单能干细胞特点▲特定组织▲可塑性：横向分化多能干细胞胚胎肿瘤干细胞(embryonal￿carcinoma￿cells,￿EC￿cells)胚胎干细胞(embryonic￿stem￿cells,￿ES￿cells)胚胎生殖干细胞(embryonic￿germ￿cells,￿EG￿cells） 是具有长期自我更新并产生机体内任何种类细胞潜能的特殊细胞群体。

一般来讲,￿多能性干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞和胚胎肿瘤干细胞Human embryo and hESCsFrom our lab. mESCs: M.J.Evans. et al. Nature, 1981, 292, 154-156hESCs: James A. Thomson, et al. Science,1998, 282, 1145 Mouse embryo and mESCs多能干细胞区别于其他细胞类型最为突出的三个生物学特性：1￿能够无限制地进行忠实的自我复制；2￿适当条件下，在自我分裂增殖过程中能够永久维持多能性；3￿将ES细胞注射到哺乳动物发育早期的胚胎中，它能够整合到胚胎中并随着胚胎的发育分化成任何可能的胚胎组织 多能干细胞之所以引起研究者的重大关注是基于其多能性的存在及由此产生的巨大潜在应用前景：在体外适当的培养条件下,￿干细胞可以被大量扩增和分化为具有特定功能的细胞因此,￿干细胞可以为临床疾病治疗提供移植所需要的细胞同时,￿由于药物筛选和安全性检验不可以直接在人体进行,￿人的干细胞也成为大规模的新药筛选和药物研究的理想模型￿￿￿￿￿￿￿￿￿以干细胞为基础的细胞替代治疗为患者带来了治愈和功能恢复的希望。

￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿寻找合适的种子细胞（丰富的细胞来源、无致瘤性、无免疫排斥、回避伦理限制并能实现功能再生）是细胞替代治疗的核心问题￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿因此，数十年来，科学家们一直致力于寻找合适的种子细胞然而，胚胎干细胞用于临床存在不可回避的局限性分离胚胎干细胞需要破坏人的胚胎，违背伦理胚胎干细胞用于移植存在致瘤性问题胚胎干细胞用于移植存在免疫排斥问题￿￿￿￿￿克隆动物多莉羊的诞生使研究者们意识到分化细胞的命运可以被逆转，自此研究者们开始探索自病人体细胞获得其自身特异多能干细胞的途径我们称体细胞重新被逆转至多能状态的过程为体细胞的多能重编程￿按著名胚胎学家Waddington的观点：细胞分化的过程就像一个球滚进山谷中，经分叉口进入可能发育的通道，停留在山谷底部，导致产生不同类型的细胞(图A)克隆动物多莉羊的诞生使研究者们意识到分化细胞的命运可以被逆转我们称体细胞重新被逆转至多能状态的过程为体细胞的多能重编程四种诱导重编程的策略SCNTIPSCs是获得病人自身特异性多能干细胞的两条途径核移植诱导重编程核移植诱导重编程（（SCNT, somatic cell nuclear transfer））——治疗性克隆治疗性克隆( (Therapeutical Cloning) ) 人的体细胞核移植面临严峻挑战￿￿￿￿￿￿￿1.人卵母细胞来源极其匮乏￿￿￿￿￿￿￿2.严格的伦理限制￿￿￿￿￿￿￿3.人卵显微操作技术尚未建立￿￿￿种间核移植策略是在上述障碍存在下的一种选择种间核移植(iSCNT,￿interspecies￿SCNT)￿：用作胞质受体的卵母细胞和核供体的体细胞源自两种不同物种的核移植。

诱导的多能干细胞iPSCs的诞生克服了胚胎干细胞伦理限制和免疫排斥两大问题诱导的多能干细胞(induced￿pluripotent￿stem￿cells,￿iPSCs)的产生即是成熟细胞在多能转录因子强制性作用下完全逆转返回至多能状态的结果，这种重编程时程犹如球逆返向上滚至小山顶部(图1B)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿里程碑文章：Yamanaka.￿Cell,￿2006.Oct4 Oct4 Sox2 Sox2 c-Mycc-MycKlf4Klf4选择的选择的2424个个Candidate FactorsCandidate Factors源自源自: :1、维持早期胚胎细胞和ES细胞多能性和发育的转录因子；2、ES细胞中特异表达的基因；3、肿瘤细胞中经常被上调的因子、同时也被证实对长时间培养（体外）的ES细胞表型具维持作用及快速增殖作用的因子（均为信号转导途径中的关键因子）；4、对多能性具负影响的因子；5、发育相关的信号分子；6、胶质细胞和突触前兴奋性神经递质；7、Oct3/4的靶基因；8、DNA甲基化转移酶外源转录因子胁迫性重编程产生的iPSCs天生存在着强烈的致瘤性和分化上的难以控制性，导致其不适合用于临床治疗。

Miura K, Okada Y, Aoi T, Okada A, Takahashi K, Okita K. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol, 2009, 27:743-745.但iPSCs应用于临床面临难以逾越的障碍重新回到人种内体细胞核移植在小鼠的体细胞核移植中证实受精后，受精卵可用于体细胞的胞质受体，并获得了核移植胚胎干细胞￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿Kevin￿Eggan,￿2007,Nature,￿447,679-685如何解决人卵母细胞来源问题？人多原核受精卵可作体细胞的胞浆供体：在人IVF中心存在着一定比例的多原核受精卵，这种多原核受精卵是临床体外授精治疗周期中受精异常的胚胎From our lab.SCNT天然的、生理的、动态的四维事件iPSCs非天然的、非生理的、二维的事件美国政府解禁人卵子用于研究导致重大突破Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell 153, 1–11, June 6, 2013 6.神经干细胞应用前景　　　　　　　　　　　　NSC具有稳定的生物学性状,建系以后可以获得均一的遗传背景,具有组织和种属特异性，可作为神经系统疾病的药物筛选平台。

利用NSC的多向分化潜能,可筛选出控制和促进NSC向终末细胞分化的药物★神经系统疾病的药物筛选平台 干细胞的蓬勃发展尤其为全球神经系统疾病患者带来了治愈的希望，因为对于其它器官的重大疾病而言,除了传统的治疗手段，尚有器官移植这一备选解决方案，但对于神经系统疾病而言，脑是不可能被移植的器官！★￿神经干细胞治疗疾病异体神经干细胞移植依据：临床试验表明，移植胎儿脑组织治疗神经系统退行性疾病可以明显改善症状；在体外培养扩增的NSC移植到脑疾病动物模型脑内的实验表明，体外培养的NSC移植到脑内后能够迁移分化为特定部位的神经细胞，其分化方向与所处的微环境密切相关问题：（１）胎脑的来源有限，受伦理和法律上的束缚，限制研究的发展；（２）在研究细胞移植治疗帕金森病时发现,在体外实验中没有必需的因素干预下,￿NSC自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5%～5%　目前报道的可用干细胞治疗的疾病种类，包括帕金森氏症阿尔茨海默氏病亨廷顿氏病脊髓和脑外伤肌萎缩性脊髓侧索硬化症中风治疗这些神经系统疾病的干细胞种类则包括可以分化为神经谱系细胞的各类干细胞，包括胚胎干细胞诱导的多能干细胞神经干细胞骨髓干细胞间充质干细胞脐带血干细胞羊水干细胞皮肤干细胞脂肪组织干细胞神经干细胞移植途径　　　　　　　　　　　　传统的药物治疗效果不令人满意，吃药只可暂时性的控制疾病，一旦停药，病症复现甚至更严重。

常年服药不仅让患者痛苦不已，而且对身体造成极大的危害，导致其他严重疾病的并发药物不具备激活脑神经细胞的功能是根本原因，所以要想从根本上治疗脑病等神经系统疾病，借助外界移植神经干细胞是唯一有效的方法￿　　　科学研究证明了神经干细胞的定向分化性，使修复和替代死亡的神经细胞成为现实为了减少神经损伤的后遗症，延缓或抑止疾病的进一步发展，取得更好的恢复效果，从根本上修复和激活死亡神经细胞是十分必要的神经干细胞治疗疾病的意义神经干细胞移植治疗研究进展——国际进展★★人胚胎干细胞技术为基础的治疗策略，其代表是Geron公司和ACT公司目前，Geron公司的ES细胞来源的神经胶质细胞已经申请I期临床试验，ACT公司的胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮干细胞治疗眼底黄色斑点症已经申请I/II临床试验；大部分关于干细胞治疗神经系统疾病研究进展是在动物实验上产生的，但其中有一些研究已进入临床试验阶段，根据所使用的干细胞类型主要分为两大模式：★成体干细胞技术为基础的治疗策略，其代表是美国￿￿StemCell公司该公司是目前唯一被FDA授权进行神经干细胞移植治疗神经系统疾病临床研究的，他们的治疗策略是用特定组织来源的干细胞治疗该组织的疾病，比如神经组织来源的神经干细胞治疗神经系统疾病。

神经干细胞移植治疗研究进展——国内研究进展 复旦大学朱剑虹教授领导的干细胞研究开发实验室从开放性脑外伤破碎的脑组织中分离神经干/祖细胞，通过CD24抗体和SP(side￿population)细胞方法富集高纯度神经干细胞，并利用这些神经干细胞在国际上首先开展了成人神经干细胞移植治疗脑损伤的临床对照研究、临床安全性研究和干细胞人脑内迁徙的活性示踪观察，其研究成果在在国际顶尖的《New￿England￿Journal￿of￿Medicine》杂志发表1.神经干细胞移植后神经是否存在有免疫反应?￿2.神经干细胞移植是否有产生肿瘤的可能?3.神经干细胞脑内移植的最佳时机是什么?4.虽然神经干细胞在取得一定进展,但大多是在动物实验上,应用于临床还需一段时间5.目前，神经干细胞的增殖、分化及定向、远距离迁移的调控机制还不清楚6.移植用细胞类型是选择神经干细胞还是定向诱导后的成熟细胞或介于两者之间的祖细胞,￿还没有系统的比较研究存在问题在进行干细胞治疗临床疗效的评估时，我们必须回答四个问题：1.￿移植后的干细胞在哪里？2.￿移植的干细胞是否能在体内存活？3.￿移植的干细胞是否能和宿主整合发挥生理功能？4.￿局部注射和静脉系统给予等不同的移植途径对干细胞组织功能重建有什么影响？￿￿￿￿￿即干细胞应用于临床治疗必须确保安全、可靠和有效，这就要求我们在将干细胞用于临床移植治疗时，能够做到对移植的干细胞在体内的行为包括迁移和功能实施无创性示踪。

￿￿￿￿寻找合适的种子细胞（丰富的细胞来源、无致瘤性、无免疫排斥、回避伦理限制并能实现功能再生）仍然是细胞替代治疗的核心问题下￿￿课￿了谢￿谢！。