PK法提全血DNA步骤.doc

精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除PK法提全血DNA（蛋白酶K法）一、试验原理：苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来DNA易溶于水，不溶于有机溶剂蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用二、步骤： 1、1ml EDTA－Na2抗凝血于10ml离心管中，加3体积1×RBC裂解液混匀，冰浴30min.2、4度10000 rpm离心10min,弃上清，加入1ml 1×细胞核裂解液（混匀，把沉淀摇起来），再加2ml 1×细胞核裂解液和150µl 20%SDS摇匀，直至出现粘稠透明状，加20µl 16mg/mlPK,摇匀，37度消化6h以上或者过夜（摇床160r/min）.3、加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温10000rpm 10min.4、用去头的吸头小心将上清液移至另一离心管中（宁少勿多），加等体积（吸下层）酚/氯仿（1:1 V/V）混匀，4度10000rpm 10min.5、小心移上清液，若上清液不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6、将上清液移入另一离心管中，加入2倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA，10000rpm 10min.7、去掉大部分上清，摇匀，将DNA转到EP管中，12000rpm 10min.8、去上清，用70%乙醇洗（加1ml, 12000rpm 10min）2次.9、室温干燥5min，再将DNA溶于50µl 1×TE中TE溶解4度可存放一年，若需长期保存，则需加2倍体积无水乙醇－70度保存）注：1、20%SDS用之前应先放到水溶锅溶解沉淀2、饱和酚是用Tris饱和的，Tris碱和HCL混合得Tris－HCL，pH在8.0左右，可用来调pH.3、酚/氯仿（1:1 V/V）混合液分两层，应吸下层氯仿试剂配方：10×RBC裂解液: NH4Cl 8.29g KHCO3 1.0g EDTA 0.037g 加ddH2O至100ml高压灭菌，4度保存1×细胞核裂解液: 2Mol Tris－HCL Ph 8.2 0.5ml 4Mol NaCl 10ml 2mMol EDTA 0.4ml 加ddH2O至100ml高压灭菌，4度保存10×TE（Tris-HCl-EDTA）: Tris-HCl(pH 8.0) 1mol/L 100mlEDTA 1mmol 500mmol/L 20ml加蒸馏水至1L，高压灭菌，室温保存【精品文档】第 页。