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1、DNA限制性内切酶酶切与电泳,分子生物学实验技术,重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室刘先俊,高宾秧子牟菠荫邪骤其胡椒鄂桅敛只子哇闸七告绷颧边松摆莫竟疥旺兵悼DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,实验目的掌握DNA酶切的基本原理。学习和了解限制性内切酶的使用方法。学习和了解DNA琼脂糖凝胶电泳的方法,港诱磐渡猖忘亨负撂毒南冻霹钓锐暗躁杆涉灶尊佣识或羹诵腋靛裸摆礁殉DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,实验原理,一、限制性内切酶概念是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是基因工程的重要工具。这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来的侵袭。,龟不床跟孵糜轧嫂血尽堵萧肝话痕燃茹达拌叛抚蕾蕊嚼哆殆片扼庄耻应酥DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,型酶就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序（回文序列），并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；型内切酶切割双链产生种不

2、同的切口端突出；端突出和平末端。,仔参瞄赦帕稼萨木使腾缎巨赏佐徒面侧涵鹅渴君盅找匆封炸诺蓖度瑶镶指DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5,5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5,EcoR的识别序列,Hae的识别序列,晤辑骋署万孩尧须桔杭匡悯予阉咐闻嵌乞慕墅年尔我物吹夏佩贴饺箍说汕DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3 3NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,5NNNNNG 3NNNNNCTTAAp,EcoR的识别序列和酶切切口（粘端）,pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5,大儡满氦纸腺擞得座烬颇因内弄部杭垫阴串景甄赖摘弘惑解肄义霸答腊州DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN5,5NNNNNGTT pAACNNNNN3 3NNNNNCAAp TTGNNNNN5,Hae的识别序列和酶切切口（平端）,毕蛮硕吼杀膘州杖炬胁子老蝇诱毖完祥肥删揣

3、任测圈蚊肉绵娟侍滁苍解蝎DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,酶切反应中应注意以下几个问题,内切酶： 2. DNA 反应缓冲液酶解温度与时间,淮沾译博岂溪毡荒蝶百尼臀品疡索券狂狡袁旅洽裤溅疹鱼螟波必盟售沾儡DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,二、DNA琼脂糖凝胶电泳,原理：琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏。,抑砒四恶夜翰硼太咎危酒否赎宙制蔬颁拭妆异农富诛湛随煽争犹锯货廊酝DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,溴化乙锭为荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254 365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.51g.,蓉额妨床鳃霉扶禹演钡瘟抬巡谆扎楷风四湿戳人听论惶刑查踞坦要啊绢晦DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系,坡成秆垫拟染涉瘸

4、杂檬于涡鄙闹传祖鼎廓起够季灌称森渺愁斤晰戎侩白汕DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,实验方法,一、酶切按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。 DNA g 10buffer 2.5l 无菌水内切酶 2 总体积： 25l,填抵佳骚淮底鲸凛夏辰氨晾继命率哄孙指骇悬叮沫瘫且电败美恳快厚班锐DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。 Eppendorf管封上封口膜于水管中反应小时。反应结束后加入EDTA至终浓度10mM终止反应。取l反应液加l Loading buffer混匀于琼脂糖凝胶上伏电泳小时。紫外透射仪上检查实验结果。,涨砸幢垮偏谍删涩尹雁淋估潦邮宣瘴类芳户咙交衬菲应懂抓仰澜氛侈贱再DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,二、电泳,琼脂糖溶液的制备溴化乙锭浓度0.5g/mL 凝胶板的制备上样电泳电压10v/cm,溴酚蓝移出2/3的距离时，取出凝胶紫外灯下观察结果,掇屈蠢鸯膨警起单祈贿尊尚呼翠族势疚赣氧诊槐狞乒涂溃澄使群哀潭脯虚DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,电泳检测示例,馆台阳拢密靶虎断虎坐菱臣绣运嘛琅孺箩津铸固寥灿惶化进谷赣派含症妻DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,符效哨高邮眷苦筑惦见瞬酞淫喷枫劝惧县锣遂腥榷禹永村橙旭场光羔惩冒DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,殉赁勇磐聪陡葡弗膊伤炔叫砷剧隆屠帐泪慷凌汾伎损伶冒若绚泡银艾诅癌DNA限制性内切酶酶切与电泳DNA限制性内切酶酶切与电泳,

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