PCR引物设计

1、生物信息学软件介绍,基因芯片相关软件 序列分析软件 RNA二级结构软件 蛋白质二级结构软件 限制酶切位点软件 质粒绘图软件 引物分析软件 凝胶分析软件 生物显微分析软件 数据统计类软件 文献管理软件,2,常用生物信息学软件,管理实验室数据及文献资料,查阅实验相关文献，对所研究课题的最新进展有一个基本的了解，从而确定自己的实验策略，同时，方便实验室结果的储存、管理和申报工作。常用软件： EndNote(可以在线查找Internet上的各种文献数据库，将查找到的资料保存入本地数据库，并自动生成格式化的参考文献清单插入各种文字处理软件） Reference Manager （可以在线通过查找关键词搜索PubMed等多个数据库中的专业资料，同时保存查找的资料为本地文件，可直接在word中查找资料，并插入引用，在文章中对引用的文献可以格式化。） 医学文献王（智能化网上检索、专业化文献管理和自动化嵌入参考文献三大特点，特长在中文期刊的系统化，也支持外文文献数据库）,3,软件功能,分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间,4,软件功能,随着实验的进行，就必须对实验过程中的DNA、RN

2、A和蛋白质的信息进行各种处理，包括限制酶分析、引物设计、同源序列比较、质粒做图，结构域查找，RNA二级结构预测，蛋白二级结构分析，三维结构显示等方面的内容,限制酶分析,推荐软件：DNA ssist 1.0 大多软件只对线性序列进行分析,那么cNNNNNNNNgaatt环状的序列就找不到EcoR I的位点。DNAssist 1.0能很容易把这个EcoR I位点找出来 DNAssist在输出上非常完美，除了图形、线性显示外，还有类似DNASIS的列表方式，列出有的位点（按酶排列，按碱基顺序排列）。 Vector NTI Suite 亦是不错的选择,5,引物设计,Primer Premier 5.0（自动搜索）Oligo 6 （引物评价）Vector NTI Suite （综合分析）Primer Express (实时定量PCR引物设计和探针设计）Omiga 2.0DNAStarPrimer 3（在线服务）,6,同源序列比对,NCBI 的Blast Expasy 的 allignmentClustal XGeneDoc 3.2 Vector NTI SuiteOmiga,7,质粒绘图,Gen

3、e Construction Kit 2.0Winplas 2.6Plasmid Premier2.02Redasoft Visual Cloning 2000SimVectorClone Manager,8,RNA二级结构,RNA Structure 3.5RNAdraw,9,序列综合分析,Vector NTI Suite 8.0Omiga 2.0DS geneDNASIS for Windows 2.5DNATools 5.1BioeditDNAMAN,10,蛋白分析软件,蛋白二级结构分析： ANTHEPROT 4.5 、 Peptool、 VHMPT （Viewer and editor for Helical Membrane Protein Topologies）、 MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench, MACAW) 三维结构显示：RasMol、Cn3D、CHIME 2.6 IE、 POV-Ray 3.5,11,凝胶分析软件,BandScan 4.30 ：通用的电泳胶条带定量分析软件，手动、自

4、动找到条带，手动的条带可以是无规则的，可以清除背景。进行分子量、百分比、质量、波峰等方面的定量分析。直接使用扫描仪，将数据输出到excel文件。 Band leader 3.0 ：小巧的凝胶图像分析软件 TotalLab 2.0 ：一个全智能化的凝胶分析软件，对DNA、蛋白凝胶电泳图像、arrays, dot blots与colonies等图像可以进行很方便的处理 PDQuest 6.2.1： bio-rad公司一个分析2维凝胶并生成数据库的标准软件。使用它，可以同时分析100个凝胶图像，生成包含1000个凝胶图像的数据库。,12,DNASIS 2.5 tRNA 二级结构预测,13,软件应用图例,Omiga 2.0 ORF Map,14,DNAStar 之 Protean 对氨基酸的亲疏水性分析：helical wheel 图,15,PrimerSelect,16,Winplas 2.6 质粒构建,17,Atheprot 5.0 预测蛋白跨膜区域,18,Antheprot 5.0 预测信号肽断裂点,19,DNASIS 2.5 对蛋白编码区的预测,20,DNASIS 2.5 对蛋白编码区

5、的预测(ORF List),21,DNASTAR GeneQuest 预测CDS,22,DNASIS 2.5 蛋白二级结构预测,23,Cn3D 2.5 显示 1EQF A链三维结构,24,RasMol 2.7 显示1EQF A链三维结构,25,本次课程内容,引物设计：PRIMER PREMIER 5.0 文献编辑软件: EndNote X4,26,引物设计实例分析,PCR原理概述,PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。,28,29,PCR原理,Sample denaturatationPrimer annealingP

6、rimer extension,PCR引物设计,引物设计有3 条基本原则： 首先引物与模板的序列要紧密互补； 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构； 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,30,引物设计需要考虑的因素,围绕这几条基本原则，设计引物需要考诸多因素，如：引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值 (melting temperature)G值(internal stability)引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）错误引发位点（false priming site）引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。,31,引物设计要点,一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，不超过38bp，过长或过短都不合适。 碱基随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 引物3端的碱基

7、一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,32,引物设计要点,G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况下，在Oligo 5.0软件的G值窗口中，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间部分G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5端与中间段的G值应较高，而3端G值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。,33,引物设计要点,引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构导致引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过 4.5kcal/mol 引物的延伸是从3

8、端开始的，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构可能,34,引物设计要点,引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 如扩增编码区域，引物3端不要位于终止密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。,35,DNA/mRNA引物的区别,DNA,36,mRNA,UCSC:,37,基因搜索,http:/genome.ucsc.edu/,38,输入待查询基因名称,39,40,目标基因,17.8.9,41,基因组、mRNA、蛋白序列,42,43,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,44,45,芯片检测结果,PRIMER PREMIER 5.0使用说明,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,47,安装Primer premier5,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,48,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,49,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,50,17.8

9、.9,广西医学科学实验中心xy,51,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,52,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,53,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,54,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,55,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,56,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,57,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,58,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,59,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,60,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,61,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,62,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,63,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,64,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,65,File菜单中的Parameter命令可以对系统参数，PCR反应条件和程序打分系统进行设置，以帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物设计，其中反应条件按照引物浓度，单价离子浓度，Mg离子浓度，Na盐浓度等。而打分系统是参照的以下公式：,根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,67,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,68,17.8.9,广西医学科学实验中心xy,69,引物设计（Primer Design），酶切分析（Restriction Sites）和基序分析（Motif）,当一个基因被识别、其DNA序列被解读时，人们往往仍然无法 弄清相应的蛋白序列是什么。这是因为在没有其它信息的前提下，DNA序列可以按六种框架阅读和翻译 （每条链三种，对应三种不同的起始密码子）。阅读框的次序（+1,+2, +3,-1,-2,-3)。,

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