207编号WB实验基本步骤

1、实验基本步骤实验基本步骤 提取细胞蛋白 BCA 定量 制备蛋白胶（SDS-PAGE 胶） 蛋白样品变性 电泳 转膜 封闭 一抗 TBST 洗涤 二抗 TBST 洗涤 显影 结果分析 试剂配制试剂配制 1.PBS 磷酸盐缓冲溶液 1L 磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g 加入 500ml 纯水，调 PH=7.2 定容至 1L,高压蒸汽灭菌 2.PBST（PBS+0.05%吐温吐温-20） 500mlPBS+0.25ml 吐温-20 3.电转液电转液 500ml Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml 水溶解 加入 100ml 甲醇，置于 4冰箱预冷 4.电泳液（电泳液（1X） 10 x 稀释，50ml10 x 电泳液+450ml 纯水 5.TBS 6.TBST（TBS+0.05%吐温吐温-20） 50mlTBS+450ml 纯水+0.25ml 吐温-20 7.封闭液封闭液 TBST1X+5%奶粉 40ml 封闭液=40mlTBST+2g 奶粉，40预热 WB 实验实验 一、蛋白样品制备一、蛋白样品制备 准备:一管细胞，PBS（4预冷）

2、，PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP 管 2 个，高速冷冻 离心机 4预冷 1.于-20冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液 2.加入 1ml 4预冷的 PBS（0.01M pH7.27.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后 4，8000r 离心 5min，然后 弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。 3.按1ml裂解液加10 l PMSF（100 mM）， 摇匀置于冰上。 （PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 4.在样品中加入 300ul 含 PMSF 的裂解液，吹匀，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回 摇动。 5.裂解完后，于 4下 12000 rpm 离心 5 min。 7.将离心后的上清分装转移倒 0.5 ml 的离心管中放于20保存。 二、二、 蛋白含量的测定（蛋白含量的测定（BCA 定量）定量） 准备：96 孔板，移液枪（1000ul，10ul，200ul），BCA 工作液（A+B），50mlEP 管，1xPBS，BSA 标准液 1.将 96 孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔

3、最好不用） 2.算好孔数 （总的） 每孔加 200ulBCA 工作液 （A+B）， （A 液 ： B 液=50:1， 一般配多些， 如 60 孔， A 液 12000ul， B 液 240ul） 3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10 倍，20 倍，30 倍），每孔需要 20ul 样品（2ul 样品+18ulPBS,即稀 释 10 倍），做三个重复则需要 60ul，一般配 80ul 4.配蛋白标准样品，将 2mg/ml 的蛋白标准溶液稀释至 0.5mg/ml，若配 200ul 的 0.5mg/ml 蛋白标准溶液则 需要 50ul 的 2mg/ml 的蛋白标准溶液和 150ul PBS 溶液 5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按 0，1,2,4,8,12,16,20ul 加到标号的区域，之后 在加标准样品的孔内，将孔内溶液用 PBS 补足到 20ul 6.每孔加 200ul 配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差 7.将加好的 96 孔板放在 37下孵育 30 分钟 8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡 3-10s,中速,吸光值 595nm,进行比色测定,记录标准

4、曲线及样品吸光值数据后, 以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2 0.98 才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1 是 结果,2 是保存） 9.计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了 10 倍） 蛋白质定量标准曲线加样量 序号序号1 12 23 34 45 56 67 78 8 标准蛋白量/ul （0.5mg/ml） 标准蛋白量/ul （0.5mg/ml） 01248121620 背景液（PBS）/ul背景液（PBS）/ul2019181612840 三、三、SDSPAGE 电泳电泳 1. 配胶（12%,可以提前配好） 准备：玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4冰箱冷藏） （1）玻璃板验漏 5min （2）按表配置分离胶 （3）灌胶，加酒精封压，凝 30min（注意不要有气泡） （4）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝 30min （5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中 4冰箱保存备用 2. 样品处理 准备：PBS，移液枪，1.5mlEP 管 （1） 稀释样品 ： 一般每孔上样 5ul， 即

5、1mg/ml 浓度的样品， 测完蛋白含量后， 将样品用 PBS 稀释至 1mg/ml（注 意 loadingbuffer 的加入也得算入） （2）取出上样样品 15ul 至 1.5 ml 离心管中，加入 6SDS 上样缓冲液 3ul 至终浓度为 1。（上样总体积 一般不超过 15 l，加样孔的最大限度可加 20 l 样品。） （3）将样品在 100煮 5 min 震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作） 3. 电泳 准备：电泳液 500ml（现配），蛋白胶，10ul 移液枪（枪头），样品，Marker，冰盒，电泳装置 （1） 将 SDS-PAGE 胶放入电泳槽中， 加足够的电泳液。 （短玻璃板面向内， 长玻璃板面向外。 若只跑一块胶， 那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。） （2） 上样。 用移液枪贴壁吸取样品， 将样品吸出不要吸进气泡。 将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。 标准液浓度 mg/ml标准液浓度 mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5 （加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样

6、品时，进样器需在外槽电泳 缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。） （3） 先设置 80V， 开始电泳， 样品溴酚蓝跑至分离胶后增至 120V 电压， 电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳， 进行转膜。（此时准备好电转液） 四、转膜四、转膜 准备：电转液（现配 4冰箱冷藏），镊子，滤纸，PVDF 膜（0.45um），电转装置，冰盒 注意：拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子，因为手上的蛋白会污染膜。 1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫 2. 滤纸浸入电转液中，PVDF 膜在甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入 4电转液中平衡至少 5min。 3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手 擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上）， 一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。 4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶， 撬的时候动作要轻， 要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动， 直到撬去玻板。 （撬时一定要小心， 玻板很易裂。） 除去小玻璃板后， 将浓缩胶轻轻刮去 （浓缩胶影响操作），

7、要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒 擀去气泡。 将膜盖于胶上， 要盖满整个胶 （膜盖下后不可再移动） 并除气泡。 在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。 最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的 滤纸不能相互接触， 接触后会发生短路。 （转移液含甲醇， 操作时要戴手套， 实验室要开门以使空气流通。） 5. 将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的 红面。一般用 100mA 转移 90min。 6. 转完后将膜用 1丽春红染液染 5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上 的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液） 六、免疫反应六、免疫反应 准备：封闭液，一抗，二抗，TBST 1 . 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 2h。 2. TBST 洗 4 次。每次 5 分钟。 3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育 2h 或者 4过夜 4. 室温下孵育 12 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗四次，每次 5min 5. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育 12 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗 4 次，每 次 5 min 七、显影七、显影 准备：样品胶片，移液枪（200ul），中枪头，吸水纸，显影液（A+B），薄镊子 一抗二抗 目的蛋白 78kd Bip 1:1000兔二抗 75kd 目的蛋白 34kd GAPDH 内参 1:5000鼠二抗 28kd 目的蛋白 17kd Sep15 1:1000兔二抗 1. 将 A 和 B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合； 2.1 min 后，取适量显影液于显影仪台面上，将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触，注意切角在左上， 即正面朝上。 应注意的是：显影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。 3.盖上盖子，将胶片进行扫描或拍照。

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