蛋白质的表达纯化 .
16页1、实验八 蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定,(1)了解重组蛋白表达的方法和意义。 (2)了解亲和层析分离纯化的方法。,实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。,本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在37,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。,材料与试剂,试剂 1 LB液体培养基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 2 氨苄青霉素:100mg/mL 3 上样缓冲液(GLB):100 mM NaH2PO4, 10
2、mM Tris, 8M Urea, 10 mM 2-ME, pH8.0 4 Washing Buffer(UWB): 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 5 Elution Buffer(洗脱): 100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 6 IPTG,实验步骤,一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中 (含100ug/mL 氨苄青霉素),37震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL(含100ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37继续培养1-3h. 4. 12,000rpm 离心10 min, 弃上清,菌体沉淀保存于-20或-70冰箱中。,二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离,纯化 1.重组蛋白的变性裂解:在冰浴中
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