基因克隆与表达 .
34页1、蛋白原核表达,卫文强 2015.12,目的基因-T 表达载体 酶切, 胶回收,连接 转化到克隆用细胞(Top10) 提质粒,酶切验证 转化到表达用细胞(BL21(DE3)) 诱导表达 SDS-PAGE,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1). DNA的纯度,影响限制性内切酶活性的因素,2). DNA的甲基化程度,dam甲基化酶(修饰GATC中的A); dcm甲基化酶(修饰CCA/TGG的C)。,3). 温度,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC,少数要求40-65 oC。,是影响限制酶活性的重要因素。,4). 缓冲液(Buffer),商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,MgCl2、NaCl/KCl: 提供Mg2+和离子强度; Tris-HCl: 维持pH; 二硫苏糖醇(DTT):保持酶稳定性; 牛血清白蛋白BSA等:有助于酶的稳定; 巯基乙醇:保持酶的稳定性,防止酶失活。,用时在冰上操作; 取酶用干燥、灭菌、新的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%; 多种酶进行酶切时,先低盐后高盐缓冲液;,关心小贴士告诉你, 使用时注
2、意事项:,连接、转化与重组子鉴定,1、连接,(1)必须是两条双链DNA。,(2)DNA 3 端有游离的-OH, 5端有一个磷酸基团(P)。,(3)需要能量,动物或噬菌体中:ATP 大肠杆菌中: NAD+,(2). 连接条件, ATP:反复冻熔,ATP活性降低,ATP溶解度不高,连接缓冲液宜分装; 单价离子:150-200mM NaCl,提高连接效果; PEG:5%以下可以提高连接效率,连接效果最好在37 ,但形成的互补不稳定; 最佳连接温度:12-16 ,较好的连接效果,互补又较稳定;,2)连接温度:,3)反应液中的成分:,目的或作用:,4)插入片段与载体的浓度比例,载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为13左右,甚至110 或更高。,增加插入片段与载体的接触机会,减少载体自我连接的现象。,化学法(CaCl2法):,转化原理:是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内(感受态细胞)。,2、转化,影响转化率的主要影响因素:, 载体本身的性质及其空间构象:超螺旋构象转化率最高;, 插入片段的大小:插入片段越
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