体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展

1、1体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展体外构建组织工程软骨的首要问题是种子细胞的来源，目前获得种子细胞的可能途径主要有以下几种：(1)培养扩增自体获得的软骨细胞；(2)同种异体软骨细胞；(3)骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞；(4)胚胎干细胞；(5)基因修饰细胞。本文就当前体外构建组织工程软骨的种子细胞研究进展综述如下：1 自体软骨细胞自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分，是终末分化细胞，具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天或者数周内会持续表达其特异细胞表型1 ，使其成为软骨缺损关节的“细胞治疗”中合适的细胞类型。使用标准化的有效培养方式培养软骨细胞，年轻人群的关节软骨细胞每天仅倍增 0.3 倍；年龄较大患者的关节软骨细胞的增生速度更低。当软骨细胞在非三维环境中培养时，经过一段时间后(一般是 3 代以后)，它们的细胞表型会发生变化，发生“去分化现象” ，表现得更像成纤维细胞的形态，表达型、型胶原，不再表达2型胶原。软骨“去分化”过程与培养条件相关。低

2、密度接种和一些特定生长因子会促进培养的软骨细胞表达成纤维样细胞形态及相关蛋白2 。另一方面，一些特殊培养条件会促进“去分化”的软骨细胞“再分化” ，恢复软骨细胞特异的生物学行为。这些特殊的培养条件包括：旋转瓶培养；高密度微团培养；高密度和悬浮培养方法，能获得形态与功能都很稳定的软骨细胞；低氧培养；固态基质支架培养，例如将细胞接种到琼脂糖上、胶原或者藻酸盐凝胶培养。软骨组织工程中将软骨细胞接种在一些海绵状载体支架上培养，可以维持软骨细胞表型3 。不同的细胞因子对软骨细胞特异分子的表达影响不同。转化生长因子 (TGF)超家族中的成员能够诱发体外培养的软骨细胞表达软骨细胞表型3 。星型包菌素(Staurosporine)一种蛋白激酶 C 抑制剂，与胰岛素样生长因子(IGF)联合应用胰岛素，或单独应用 IGF，肝细胞生长因子(HGF)，和成纤维细胞生长因子(FGF)都能够促进软骨特异性细胞外基质产物的表达5 。应用自体软骨细胞会造成供体部位的损伤，供体软骨部位的相关研究目前尚未见文章报道。为了获得健康软骨组织，分离软骨细胞，需要额外的手术，但易带来手术相关的并发症，如感染、疼痛等。32 同种异

3、体软骨细胞同种异体软骨组织作为一种移植物来源，因其独特的结构和免疫学特性，而引起研究者和临床医生的兴趣。组织学方面，软骨组织内部无血管、淋巴管和神经，其营养靠软骨基质的可渗透性从组织液中获得。软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，软骨囊成为其天然屏障，可阻挡免疫细胞直接侵入；软骨组织具有抗原性弱、不易被机体免疫系统攻击和排斥等特点10 。因此同种异体软骨细胞是一种值得研究的种子细胞。Wakitani 即于 1989 年以同种异体软骨细胞组织工程化技术成功修复了兔关节软骨表面缺损6 。大量研究结果已经证明7 ，同种异体软骨细胞可在受体内长期生长并保持分泌基质的功能，这为应用组织工程技术预制同种异体软骨组织提供了可能。同种异体来源的软骨细胞具有来源广泛、取材容易、一次可获取大量细胞、并且在三维培养环境和或生长因子作用下可保持软骨细胞的生理特性等特点。近年来对于胚胎来源的软骨细胞研究较多。且动物实验及多种免疫学检查证实，胚胎来源的软骨细胞所形成的新生软骨比新生及成年动物来源的软骨细胞所形成的新生软骨在受体体内存留的时间要显著延长。胚胎软骨细胞的免疫原性比异体成年细胞大大降低，提示胚胎来源的软骨细胞可以

4、作为组织工程化软骨组织的一种种子4细胞来源。但是考虑到组织相关的免疫反应和疾病传播等方面的影响，同种异体软骨细胞用于治疗软骨缺损的方案缺乏足够的吸引力。3 骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞软骨细胞作为软骨缺损细胞治疗的种子细胞，在软骨细胞来源和体外培养条件下维持软骨细胞表型等方面有很多难题，目前尚难于解决。这引导人们研究其它类型的种子细胞。有些研究显示在体内和体外环境中，特定的条件会诱发自体骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSC)、肌肉和脂肪组织来源的干细胞表达软骨细胞表型。骨髓基质干细胞以其来源充足、取材方便、创伤小、无排斥反应、增殖能力强、可大量培养扩增等优点，被公认有可能成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。目前诱导 BMSC 向软骨细胞转化的实验研究已取得成功8 。高密度接种或者低氧条件培养以及一些特殊的生长因子会促进 BMSC 向软骨细胞方向分化。研究表明，将离心微球化(pellet)的 BMSC 在含有 TGF 无血清培养液中培养，2 周左右即可获得富含细胞外基质的软骨细胞，组织学检查可见软骨细胞样陷窝9 。同样，肌肉和脂肪组织来源的干细胞经

5、体外诱导均可表达软骨细胞表型。2003 年 Dragoo 等证实将来源于人髌骨后脂肪垫的脂肪干细胞植入纤维蛋白胶， 经成软骨诱导5后，在体外和裸鼠体内都出现成软骨的表型，有透明软骨形成。该研究提示以人脂肪干细胞为基础的软骨工程有可能在临床上用于治疗软骨缺损10 。此外，激素类物质，如地塞米松、生长激素、甲状旁腺素、性激素以及维生素等都对骨髓间充质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞向软骨细胞转化有诱导作用。对生长因子的作用以及生长因子与全身激素类物质之间的协同或拮抗调控方式和调控机制的进一步研究，有望使骨髓基质干细胞、肌肉和脂肪组织来源的干细胞转化的软骨细胞，早日成为软骨组织工程的充裕的种子细胞来源。但是这种细胞有一种明显的缺点，他们会进一步分化成肥大软骨细胞，甚至发生磷酸类无机物矿物质沉积和软骨内钙化11 。4 胚胎干细胞种子细胞的老化是组织工程中的一大难题。一些分化和增殖能力 强的原始细胞，即干细胞，是解决这一难题的希望所在。目前研究较 多的是骨髓基质干细胞，而胚胎干细胞因其具有全能性和无限增殖的 能力，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。胚胎干细胞是从着床 前胚胎(孕 35 d)的

6、内细胞团中分离所得，在体外进行培养的一种高 度未分化的细胞。目前大部分胚胎干细胞诱导软骨细胞分化的实验都 集中在小鼠实验中12 。尚存在下述问题:(1) 如何控制干细胞向特 别类型细胞分化;(2) 如何分离极为纯化的干细胞6也是一个难题;(3)小鼠胚胎干细胞注射在成年鼠皮下可以形成畸胎瘤，是否分化 后的种子细胞在宿主体内不具有致瘤性还不得而知。5 基因修饰细胞细胞疗法和组织工程为体外基因治疗提供了理想的协同方法，因 为人体内的基因转移受安全问题和缺乏合适载体的制约。载体不用直 接进入人体，基因修饰细胞在移植前可以被广泛筛选，因此体外基因 转移是更安全的。而且，在人体内高浓度的软骨基质可能限制载体进 入细胞的通道，所以基因向软骨细胞内导入需要体外技术。人们对标 记基因如 LacZ(编码半乳糖苷酶)向不同骨骼肌肉组织的转运进行了 可行性研究13 。基因修饰过的间充质干细胞在骨科也被证明是组织修 复的有用物质14 。此外，最近研究表明：通过腺病毒载体向人体和犬 的半月板和椎间盘细胞转染 TGF 基因后，基质的合成增加。Goto 等分别用逆转录病毒和腺病毒载体将报告基因 LacZ 转入犬和人的

7、软 骨细胞，再将经基因修饰的软骨细胞移植于软骨缺损部位，结果表明前者可表达 LacZ 基因达 3 周，而后者可持续 6 周。在此基础上，将 TGF 基因转导入体外培养的软骨细胞，发现胶原及非胶原蛋白、蛋白聚糖的合成明显增加15 。Nixon 等将含有类胰岛素生长因子-1(IGF-1) 基因的腺病毒转入马的关节软骨细胞，结果证实转染了腺病毒的软骨细胞能够维持软骨细胞的表型并且在 28 d 的单层培养中表达局部高含量的 IGF-1，同时7能够导致腺病毒积聚16 。IGF-1 能够维持正常软骨内环境新陈代谢的相对稳定并且提高软骨在体内的愈合，而腺病毒的有效积聚能够对软骨基质基因的表达和蛋白聚糖的形成有明显的促进作用。另外，有学者进一步的实验认为以成纤维细胞为中介将生长因子导入鼠的关节可以诱导软骨形成但避免了直接病毒基因转导的不足。Gelse 等将负载 BMP-2 的腺病毒载体分别导入鼠的膝关节和成纤维细胞再将经基因修饰的成纤维细胞植入鼠的膝关节，二者比较显示直接注入 BMP-2 的鼠的膝关节间充质周围诱发新的软骨形成，伴随着广泛的骨赘形成；而通过成纤维细胞再导入鼠的膝关节的软骨形成仅仅在导入

8、细胞的附近区域。更重要的是以成纤维细胞为介导的基因转导避免了腺病毒作为直接载体的强烈的免疫反应以及不良的载体的传播17 。尽管将具有免疫抑制作用的基因转入种子细胞可克服同种异体甚至异种细胞的免疫原性，大大地拓展了软骨组织工程种子细胞的范围。但是，软骨细胞介导的基因治疗研究还处于基础研究和动物实验阶段，有待进一步探索。随着能够对转入基因进行有效的控制，形成一套合理的筛选生长因子、激素和选择有效的转染方法等问题的解决，转基因细胞将成为组织工程化软组织的种子细胞的另一大新的来源。6 问题与展望自体软骨细胞的体外培养技术相对比较成熟，已经开始应用8于临床治疗研究，但是后四种细胞技术尚不成熟，目前还处于基础研究阶段。对于种子细胞的去分化现象、免疫原性、致瘤性、生长因子的合理选择和有效的转染方法等问题应有待于更深一步的研究和探讨。理想的软骨种子细胞应具备：(1)取材方使，供体损伤小，来源充足；(2)体外培养增殖能力旺盛，能持续保持细胞表型不变；(3)植入体内能适应受区环境并保持或恢复原有细胞的功能。尽管间充质干细胞到目前为止在软骨修复中似乎是最有前途的细胞。但仍然缺乏更深入的研究，尚不能最终判断最

9、佳的细胞类型。因而需要进一步深入研究以明确每种细胞的优点和不足，使其在临床上都能发挥其潜能，为人类造福。 【参考文献】1 Aulthouse AL，Beck M，Griffey E，et al.Expression of the human chondrocyte phenotype in vitroJ In Vitro Cell Dev Biol,1989，25(7) ：659-668 2 Watt FMEffect of seeding density on stability of the differentiated phenotype of pig articular chondrocytes in cultureJ Cell Sci,1988，89(3)：373-3783 孙天威，杨志明天然生物支架材料在软骨修复中的研究进展J 中国矫形外科杂志，2006，14(6)：461-465.94 Song SU, Cha YD, Han JU, et al. Hyaline cartilage regeneration using mixed human chondrocytes and transforming growth factorbetal producing chondrocytesJ.Tissue Eng, 2005,11(9-10):1516-1526.5 Takahashi T, Ogasawara T, Kishimoto J, et al. Synergistic effects of FGF-2 with insulin or IGF-I on the proliferation of human articular chondrocytesJ.Cell Transplant, 2005,14(9):683-693.6 Wakitani S, Goto T, Young RG,et al. Repair of large fullthickness articular cartilage d

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