体外构建的HTAHSP70BCG冲激的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用

1、1体外构建的 HTAHSP70BCG冲激的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用作者：孙光，郭连英，沈洁，刘丹丹，施广霞，钱振超【摘要 】 目的 观察体外构建的榄香烯复合瘤苗抗原 卡介苗热休克蛋白 70 复合物（HTAHSP70BCG ）诱导的树突状细胞疫苗的抗肿瘤效应。方法 来源于小鼠的肝癌 HcaF 榄香烯复合疫苗的抗原（HTA ）与卡介苗来源的 HSP70（HSP70BCG）在体外构建成HTAHSP70BCG 复合物，用 GMCSF 和 IL4 诱导树突状细胞（DCs ） ，分别用 HTAHSP70BCG、HTA 和 HSP70BCG 对其冲激。用 MTT 法检测该 DCs 刺激的全脾细胞的增殖活性及被刺激的脾细胞的细胞毒活性。用流式细胞仪检测 DCs 表面 CD86 和 CD40 的表达。结果 体外构建 HTAHSP70BCG 可以诱导 DCs 成熟，表现为DCs 表达 CD86 和 CD40 上调，该 DCs 可以刺激全脾细胞增殖并使其产生特异性杀瘤活性，其强度明显大于 HTA。结论 体外构建HTAHSP70BCG 复合物可以诱导 DCs 成熟，该 DCs 可以激活脾细胞产生较强的特异性

2、抗瘤效应。 【关键词】 热休克蛋白 70；树突状细胞；肿瘤瘤苗；抗瘤效应2基金项目：教育部高等学校骨干教师资助计划Antitumor Effects Induced by Dendritic Cell Vaccine Pulsed with HTAHSP70BCG Complex Reconstituted in VitroAbstract：Objective To investigate antitumor effects induced by dendritic cells (DCs) pulsed with complex of tumor antigen from elemenecombo tumor cell vaccineheat shock protein 70 of BCG (HTAHSP70BCG).Methods Tumor antigen peptides from elemenecombo HcaF cell (HTA) combined with HSP70BCG into HTAHSP70BCG in vitro. DCs were induced in m

3、edium with GMCSF and IL4 and pulsed with HTAHSP70BCG, HTA and HSP70BCG, respectively. The proliferation stimulating effects on unseparated splenocytes and the cytotoxicity of the splenocytes activated with DCs were evaluated with MTT assay. The expression of CD40 and CD86 on the surface of DCs was assessed by flow cytometer.Results Pulsing of HTAHSP70BCG resulted in DCs maturation, characterized by upregulation of CD86 and CD40. Proliferation index of unseparated splenocytes from HTAHSP70BCG gro

4、up was significantly increased as 3compared with HTA group. Unseparated splenocytes from DCs pulsed with HTAHSP70BCG revealed the cytotoxicity agaist HcaF, The HTA failed to reveal the cytotoxicity against HcaF.Conclusion HTAHSP70BCG could induce DCs maturation and the mature DCs could activate splenocytes to generate more potent specific antitumor effect.Key words： Heat shock protein70； Dendritic cell； Tumor vaccine；Antitumor effects0 引言热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是细胞受到应激时新合成或合成增加的一组蛋白质，被称为分

5、子伴侣，在细胞抗原的加工和提呈方面起重要作用1 。分枝杆菌 HSPs 与相关抗原形成融合蛋白可诱导特异性 T 细胞反应，分枝杆菌 HSP70 富含 T、B 细胞表位，是细胞免疫的重要靶点，可被用来作为疫苗的载体2 。现已证明，从肿瘤细胞来源的 HSPs肿瘤肽复合物可诱导抗肿瘤免疫应答3，4 ，HSP70BCG 能通过树突状细胞（Dendritic cell，DC）表面 TLR4 途径诱导 DC 成熟 5 。本实验采用榄香烯处理的 HcaF 肿瘤抗原（ Tumor antigen of HcaF treated with elemene，HTA ）在体外与卡介苗热休克蛋白 70（HSP70BCG ）4构建成肿瘤疫苗 HTAHSP70BCG，探讨其抗瘤效应及机制。1 材料1.1 实验动物与瘤株BALB/C 近交系小鼠，引自中国医学科学院北京药物研究所。HcaF 肝癌细胞株由本校凌茂英教授惠赠。L929 小鼠成纤维细胞瘤细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所张友会教授惠赠。1.2 主要试剂RPMI 1640（GIBCO，USA） ；胎牛血清、rmIL4、rmGMCSF （Sigm） ；FITC

6、抗小鼠 CD40、PE 抗小鼠 CD86 抗体（San Diego，CA） ；ADP( Trinity Biotech，Ireland)。2 方法2.1 HTAHSP70BCG 的体外构建按本室常规方法制备榄香烯复合瘤苗，细胞浓度调至51108/ml，用电动匀浆器研磨制成细胞匀浆，超速离心 100 000g，取上清组分作为粗制肿瘤抗原（ HTA） 。超声碎 BCG 菌，超速离心后取上清，用 ADP 亲和层析法6 分离卡介苗 HSP70，提取物经 SDSPAGE 电泳和 Western blot 鉴定。分别用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。按比例将两类成分混合加 ADP，使之相互作用形成复合物。2.2 DC 的诱导及冲激按本室常规方法获得小鼠骨髓细胞，用含 15%胎牛血清的RPMI 1640（含 20ng/ml IL4 和 20ng/ml GMCSF）培养液将其浓度调到 1106/ml，在 37、5%CO2 条件下培养，第 3 天换液，第 6 天收集不粘附细胞为骨髓树突状细胞 (不成熟树突状细胞),将其浓度调至 1106/ml，分别加入 HSP70BCG、HTA、HTA HSP70BCG 至

7、终浓度 25g/ml，培养 24h，收集细胞做细胞表型分析和冲激全脾细胞。2.3 DC 对全脾细胞的刺激作用按本室常规方法获取全脾细胞，全脾细胞浓度调至 4106/ml，不同处理的 DC 浓度为 4105/ml，各取 100l 加入 96 孔板培养，于 72h 以 MTT 法测定增殖活性，以刺激指数为指标，其计算公式6为：刺激指数（SI）=实验组 OD595/对照组 OD5952.4 刺激后的脾细胞的细胞毒活性将不同处理的 DC（浓度为 4105/ml）与全脾细胞（浓度为4106/ml）共同培养 5 天，收集该细胞为效应细胞,细胞浓度调为4106/ml，以 HcaF、L929 为靶细胞，细胞浓度调为4105/ml，各取 100l 加入 96 孔板（ET=101） ，并设单纯效应细胞和靶细胞组，培养 72h，在终止实验前 4h，加MTT（5g/ml ）20l，于 OD595 测光密度值，计算细胞毒效应：细胞毒效应（%）=1- （ODE+T-ODE/ODT） 100%2.5 统计学处理实验数据均用(s)表示，采用 SPSS11.5 软件处理，进行 t 检验。3 结果3.1 DC 经 HSP

8、70BCG、HTA 、HTA HSP70BCG 冲激后表型的变化骨髓细胞经 GMCSF 和 IL4 诱导 6 天获得 DC（不成熟7DC） ，该 DC 经 HSP70BCG 和 HTAHSP70BCG 冲激后，其表面CD86、CD40 表达上调，但 HTA 冲激仅 CD86 上调，对 CD40 影响不大,见图 1。CD40+ cells are in the upper right quandrant；CD86+ cells are in the upper left and right quandrants.图 1 DCs 的 CD86 和 CD40 的表达3.2 冲激后的 DC 对脾淋巴细胞的刺激作用将不同 DC 与小鼠脾淋巴细胞培养 3 天，HTAHSP70BCG 和HSP70BCG 冲激的 DC 加脾细胞组的增殖指数大于 HTA 冲激的 DC加脾细胞组（P0.05） ，见表 1。表 1 全脾细胞与不同 DC 培养72h 时的细胞增殖活性测定（略）3.3 刺激后脾细胞的细胞毒作用脾淋巴细胞经 HTA 冲激的 DC 刺激后，对 HcaF 和 L929 细胞无明显杀伤作用（与各自对照

9、相比 P0.05） ，HSP70BCG 冲激的DC 致敏的脾淋巴细胞均能杀伤 HcaF 和 L929 细胞（与各自对照相比 P0.01） 。而经 HTAHSP70BCG 复合物冲激的 DC 刺激的脾细胞对 HcaF 细胞有较强的杀瘤活性（与对照和 HTA 相比P 0.01） ，对 L929 细胞仅有微弱的杀伤活性（与对照和 HTA 相比8P 0.05） ，见表 2。表 2 DC 刺激的全脾细胞的细胞毒作用（略）4 讨论肿瘤细胞由于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC) 类分子表达低下及共刺激分子的缺乏，导致自身提呈抗原能力低下，肿瘤特异性 T 细胞的激活必需依赖于抗原提呈细胞的帮助。DC 是体内最重要的抗原提呈细胞，能够有效摄取、加工肿瘤抗原，再经 MHC 类分子、MHC 类分子提呈给 T 细胞使之激活，产生特异性的抗肿瘤免疫反应7 ，它在免疫系统中占有中心枢纽的作用8 。肿瘤抗原肽是一类小分子物质，难以被DC 捕获。热休克蛋白作为一种分子伴侣，可以结合抗原肽，在 DC膜表面有其高亲和力受体，可将抗原肽提呈给 DC9 。这些发现为在体外构建肿瘤抗原肽热休克蛋白疫苗提供了理论基础。我们从榄香烯处理的 HcaF 肝癌细胞提取肿瘤抗原（ HTA） ，从卡介苗中提取 HSP70（HSP70BCG ） ，根据 HSP70 与蛋白质/多肽结合与解离的特性，在 HTA 与 HSP70BCG 混合物中加入 ADP使它们形成 HTAHSP70BCG 复合物，以期 HSP70BCG 能将 HTA提呈给 DC，再由 DC 将 HTA 加工、处理后提呈给 T 细胞，并使之激活，产生特异性杀瘤效应。结果显示，HTA 与 HSP70BCG 结合成复合物 HTAHSP70BCG 后，可以诱导 DC 成熟，表现为 CD869和 CD40 的上调，该 DC 可进一步活化淋巴细胞，使淋巴细胞产生增殖反应并诱导出杀瘤活性，在体外证实了 HTAHS

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