人胎盘与脐动、静脉血造血干-祖细胞归巢相关黏附分子表达的研究

1、1人胎盘与脐动、静脉血造血干/ 祖细胞归巢相关黏附分子表达的研究作者：苏蕊，陈代雄，方宁，陈琦，龚芳泽【摘要 】 为了评价人胎盘组织造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）的归巢能力，采用机械法制备人胎盘组织单个细胞悬液，用流式细胞术分析胎盘组织及脐动、静脉血有核细胞中 CD34+细胞及其亚群的含量，检测三者来源的 CD34+细胞表面归巢相关黏附分子CD44、CD11a、CD62L、CD49d 、CD49e 和 CD54 的表达水平。结果显示，胎盘组织 CD34+细胞及 CD34+CD38-细胞百分率明显高于脐动、静脉血；脐动脉与脐静脉血中 HSPC 百分率没有明显差异。胎盘来源 CD34+细胞高度表达黏附分子CD11a、CD49d 、CD44、CD49e 及 CD54，其中表达 CD49e 及CD54 水平明显高于脐动、静脉血 CD34+细胞。胎盘来源的CD34+CD62L+细胞百分率为(64.5815.52)%，低于脐静脉血来源的表达。结论：人胎盘富含 HSPC。胎盘来源的 CD34+细胞多数黏附分子的表达水平近似或高于脐血，

2、提示胎盘 HSPC 的归巢能力有可能强于脐带血。 2【关键词】 胎盘Expressions of Homing-Related Adhesion Molecules in Hemato-poietic Stem/Progenitor Cells Derived from Human Placenta， Umbilical Cord Arterial and Venous BloodAbstract The aim of this study was to evaluate the homing capabilities of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) derived from human placenta tissues (PT). Single cell suspension of human PT was prepared by mechanical method. The expression levels of homing-related adhesion molecules (HRAM) including CD

3、11a，CD49d ，CD44，CD49e，CD62L and CD54 on CD34+ cells and the percentages of CD34+ cells and their subpopulations in nucleated cells (NC) from fresh human PT，umbilical cord arterial blood (UCAB) and umbilical cord venous blood(UCVB) were detected by using flow cytometry. The results showed that the percentage of CD34+cells and CD34+CD38- cells in placenta were higher than those in UCAB and UCVB. There were no significant difference in percentage of HSPC between UCAB and UCVB. Placenta-derived CD34

4、+ cells strongly expressed 3CD11a，CD49d ，CD44，CD49e and CD54，among which expression levels of CD49e and CD54 on placenta-derived CD34+ cells were significantly higher than those on UCAB and UCVB-derived CD34+ cells. While the percentage of CD34+CD62L+ cells in placenta was only lower than that in UCVB. It is concluded that human placenta is rich in HSPC. Moreover，the expression levels of most HRAM in CD34+ cells from PT are higher than those from UCAB and UCVB or are close to them. It suggested

5、that HSPCs derived from PT might have stronger homing capabilities than those from UCB.Key words placenta; umbilical cord artery; umbilical cord vein; hematopoietic stem/progenitor cell; adhesion molecule; homing自发现脐带血富含造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC）以来，脐血 HSPC 的移植已成为治疗骨髓造血功能衰竭、恶性血液病、重症免疫缺陷、某些遗传病等疾病的重要手段1-4 。但是，单份脐血所含的 HSPC 数量难以使一个成人获得造血干细胞重建。因此，寻找富含 HSPC 的新资源是非常必要的，国内已有学者发现胎盘组织中含有比脐带血更丰富的4HSPC5 。作为 HSPC 的成功移植，除要有足够数量的 HSPC 外，还要求 HSPC 能及时、高效地归巢至骨髓造血微环境“龛” ，这对 HSPC 的植活与造血重建具有决定意义

6、6 。HSPC 表面黏附分子的正常表达是干细胞移植时 HSPC 实现归巢及成功植入的关键。本研究中，我们利用了胎儿胎盘血循环的特点，即脐动脉血是由胎儿流到胎盘，而脐静脉血则是由胎盘流回胎儿，分别测定脐动、静脉血及胎盘组织中 HSPC 的含量及三者 CD34+细胞表面黏附分子的表达，初步探讨了胎盘HSPC 的归巢能力，以期为人胎盘 HSPC 最终应用于临床移植提供有价值的实验依据。材料和方法主要试剂荧光标记的 CD 分子系列单克隆抗体，anti-human CD34 Cy-chrome 购自美国 PharMingen 公司。 FITC 标记的 CD38 单克隆抗体、CD49d 单克隆抗体和 CD54 单克隆抗体及 PE 标记的CD11a 单克隆抗体均购自晶美公司，PE 标记的 CD62L 及 CD44 单克隆抗体购自 Biolegend 公司，FITC 标记的 CD49e 单克隆抗体购自 SBA 公司。IMDM 培养液为 Sigma 公司产品。5胎盘和脐带血标本经知情同意后，无菌采集足月分娩胎儿的胎盘和脐动、静脉血标本 6 份，乙肝表面抗原（ HBsAg）均为阴性。新生儿娩出后，在距胎儿

7、脐部最近端结扎两处，从中间剪断脐带。胎盘残存于子宫内，并将距胎盘最近端脐带夹闭以防止血液流出。碘伏充分消毒脐带，用注射器分别穿刺脐动脉和脐静脉，收集脐带静脉血及动脉血各约 5 ml 于收集管内，同时收集胎盘。脐动、静脉血分别用肝素抗凝（终浓度均为 20 U/ml） ，4 小时内进行实验。胎盘细胞的制备用 Hanks 液冲洗除去血块，剪碎胎盘组织，并反复冲洗，尽量除去血液。将组织块浸泡于 IMDM 培养液，采用搓网法分离细胞，收集细胞悬液，用 320 目尼龙网过滤，115g 离心 3 分钟，收集细胞沉淀，悬浮于 IMDM 培养液中，台盼蓝染色示细胞活力95%，调整细胞浓度为 1107/ml。多色荧光染色分脐动、静脉血组和胎盘细胞悬液组，每组样品 100 l 均分6别与以下荧光标记的 CD 分子抗体组合进行染色。用小鼠 IgG 作同型对照。 CD34 PECy5 20 l，CD38FITC 10 l； CD34PE Cy5 20 l，CD49d FITC 10 l 和 CD11aPE 10 l； CD34PECy5 20 l，CD49eFITC 10 l 和CD44PE 20 l； CD3

8、4PECy5 20 l，CD54FITC 10 l，CD62LPE 20 l。充分混匀，室温避光静置 20 分钟。每管加入 2 ml 红细胞裂解液，混匀，室温静置 10 分钟，180g 离心 5分钟，弃上清，重新悬浮细胞。每管加入 2 ml 含 1 g/L NaN3 的PBS，混匀，180g 1%的多聚甲醛，混匀，2-8避光放置，逐一上机分析。流式细胞仪检测表面标志应用流式细胞仪（FACS Calibur， Becton Dickinson）对荧光染色的胎盘细胞和脐动、静脉血样品进行 HSPC 含量及表面黏附分子表达检测。样品的采集和分析采用 Cell Quest 软件，根据淋巴和单核细胞的大小设定 CD34 细胞门。统计学处理应用 SPSS 11.0 软件处理实验数据，以 xSD 表示。若方差齐性，则采用方差分析；若方差不齐，则采用非参数检验。7结果CD34+细胞及其亚群的含量实验结果表明，脐动脉血和脐静脉血之间 HPSC 含量无显著性差别，胎盘组织和脐动脉、静脉血中 CD34+细胞百分率分别为（2.990.55）% 、 （1.460.39 ）% 及（1.530.33）%，CD34+

9、CD38-细胞百分率在胎盘组织为(1.400.53)%，显著高于脐动脉、静脉血（0.080.04，0.210.20)。这说明胎盘组织中含有比脐带血更丰富的 HSPC（表 1） 。Table 1. Comparison in proportional distribution of hematopoietic stem/progenitor cells in nucleated cells from placenta tissues，umbilical cord arterial and venous blood（略）脐动脉、静脉血和胎盘组织中 CD34+细胞表达黏附分子的百分率从表 2 可以看出，CD11a、CD49d 和 CD44 在脐动脉、静脉血及胎盘组织来源的 CD34+细胞中均呈现高表达率，但三者之间均无显著性差异（P0.05） 。胎盘组织 CD34+细胞表达 CD49e 和CD54 分子百分率分别为(85.362.68)%和(72.4411.58)% ，显著高于脐动脉(27.1811.00 )%和(22.8913.58)%及脐静脉血8CD34+细胞表达(34.1511.61) %和(28.3913.38)% ，三者之间均有非常显著差异（P0.001，附图） 。脐动脉、静脉血和胎盘来源的 CD34+细胞中 CD62L 表达率分别为 (76.46 9.88)%、(81.6210.02)%和(64.5815.52)%，与脐静脉血相比，胎盘CD34+表达 CD62L 偏低（ P0.05） 。Table 2. Expression of homing-related adhesion molecules on CD34+ cells from placenta tissue，umbilical cord arterial and venous blood (略)讨论自 Takahashi7发现小鼠胎盘绒毛膜具有造血功能后，曾凤华等8采用免疫组织

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