硅胶柱层析的操作方法
2页1、硅胶柱层析一、硅胶柱层析的原理利用吸附原理,即利用硅胶对中药混合物中各种成分吸附能力的差异,而使 混合物中各成分得以分离的色谱方法。二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项1、装柱操作要点:装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防吸附剂外漏。有干法装柱和湿法 装柱两种方法 (1)干法装柱:将硅胶通过漏斗装入柱内,中间不应间断,形成一细流慢慢加 入管内。也可用橡皮槌轻轻敲打柱硅胶柱使硅胶装填连续均匀、紧密。柱装好后, 打开下端活塞,然后倒入洗脱剂洗脱以排尽柱内空气,并保持一定液面。 (2)湿法装柱:将最初准备使用的洗脱剂装入柱内,打开下端活塞,使洗脱剂 缓慢流出。然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内(或将硅胶与适量洗脱剂调成混 悬液慢慢加入柱内,),硅胶依靠重力和洗脱剂的带动,在柱内自由沉降,此间要 不断把流出的洗脱剂加回柱内保持一定的液面,直至把硅胶加完并在柱内沉降不 再变动为止。然后在硅胶上面加一小片滤纸或少许脱脂棉。根据加样量控制洗脱 剂液面至一定高度。匀浆法: 搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果 洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体 系,就用氯
2、仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯 /丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯 仿用无水氯化钙干燥,以除去 1%的醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱。2、上样将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中,制成体积小、浓度高的样品 溶液,加入层析柱中硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂,则将样品溶于 易挥发的溶剂中,并加入适量硅胶(不超过柱中硅胶全量的 1/10)与其拌匀,除 尽溶剂,将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶(始终保持洗脱剂有一定的液面),再 覆盖一层硅胶即可。上样时注意沿着柱内壁慢慢加入,始终保持硅胶上端表面平 整;上样量为硅胶的 1/601/30。3、洗脱洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选,一般TLC展开时Rf值为0.20.3的溶 剂系统是最佳的洗脱系统,采用梯度洗脱法洗脱。先打开柱下端活塞,保持洗脱 剂流速12 滴/秒。上端不断添加洗脱剂(可用分液漏斗控制添加速度与下端流 出速度相近)。如单一溶剂洗脱效果不好,可用混合溶剂洗(一般不超过三种溶 剂),通常采用梯度洗脱。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。4、收集处理等份收集洗脱液,每份收集量大概与所用硅胶的量相当。每份洗脱液采用薄 层定性检查,合并含相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单 体成分。如仍为几个单体成分的混合物,不易析出单体成分的结晶。则需要进一 步层析或用其他方法分离。注: (1)柱色谱分离能力比薄层分离能力强,效果更好,尤其对结构相似、性质 接近、采用薄层难以分离的成分分离效果好。(2) 洗柱子能不用含水的混合溶剂,就尽量不要用。
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