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质粒DNA的提取和纯化试验报告
5页1、质粒dnA勺提取和纯化实验报告实验一、质粒DNA的提取和纯化实验目的:1学习并掌握碱裂解法小量制备质粒 DNA勺方法。2、初步了解DNA屯化的原理。二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的 DNA大小范围从1kb至200kb以上不等。 各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆 地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后 代。2 、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量 纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒 DNA的提取,本实验采用 碱裂解法提取质粒 DNA。3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA勺方法,其基本原理为:当 菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与 DNA发生变性,当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色 体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒 DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如,氯化铯 - 溴化乙锭梯
2、度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二 醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及 探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用。三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含 Amp的LB液体培养基试管内(3.5ml/管)2、 将试管放入恒温震荡培养箱中,37C, 200r/min培养12-16h。3、 将菌落转入1.5ml离心管中(尽量倒满)1200r/min,离心30s (沉淀菌体)4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干,加入预冷的 Solution1 100 微升,剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的 Solution2 200 微升,温和颠倒试管 6-7 次混匀,室温放置 5min, 使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的 Solution3 150 微升,温和颠倒离心管 2-3 次,震荡 7-8 次,之 后在 1200r/min 离心 7min8、小心将含有质粒DNA勺上清液转移到另一离心管中(400-50
3、0微升)9、加等体积的氯仿,轻微震荡, 1200r/min ,离心 2min, 之后将上清液转移至另 一离心管10、加入 2倍体积冰冷无水乙醇,轻轻颠倒离心管混匀, 室温放置 2min,1200r/min 下离心 10min11、 弃上清,加入70聽醇洗涤沉淀,12000r/min,离心2min,弃上清12、 弃上清,液体尽量倒净,并在吸水纸上扣干,室温静置15min 干燥13、加入 1*TE 40 微升溶解质粒,用于定量分析、电泳检测等实验二、 DNA 琼脂糖凝胶电泳一、实验目勺1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关勺技术和识读电泳图谱勺方法。二、实验原理1、关于电泳技术: 电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子尤其是蛋白质和核酸。正因为如此,电泳已成为 生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一,其中在分子生物学实验中 最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。 琼脂糖是一种海藻多糖,琼脂糖胶分离范围 很大,但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳 技术可以分离 200到50,000 bp 大小的 DNA 片断。一般琼脂糖胶浓
4、度在 0.5 到 4之间,且琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于 较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。2、 琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断 DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后,就可以通过 Gelview染色来观察DNA 片断。 Gelview 是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色,也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的 Gelview 溶液中进行染 色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或 RNA4行观察。3、 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷,在电场中向正极移动,由于磷酸骨架在结构 上的重复性质,相同数量的双链 DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以相 同的速度向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛 效应,即DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样,可
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