植物组织培养实验指导

1、2012.3附录培养基母液的配制一、实验目的：掌握培养基母液配制的方法。二、实验原理：配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培养基为例，所需配制的母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长物质母液，在不同类型的培养基中使用。三、实验器具与药品：电子分析天平、托盘天平、烧杯(50ml,100ml,500ml,1000m)、量筒(1000ml,100ml,2Kn容量瓶(1000ml,500ml,10)n药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱。配制MS培养基所需药品按培养基的配方准备。植物生长调节物质，2,4-D,NAA,6-BA等。四、培养基母液的配制过程首先，按下表“MS培养基母液的配制”将各种母液根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量，然后，分别进行药品称取和母液配制。母液种类成分规定用量ml/L扩大倍数称取量mg母液定容体积ml配1LMS+吉羊甘nK培养基吸取

2、量ml1.日一*大量兀素KNO3190038000NH4NO3165033000MgSO47H2O370207400100050KH2PO41703400CaCl22H2O4408800微量兀素MnSO44H2O22.322300ZnSO47H2O8.68600H3BO36.21000620010001KINa2MoO4.2H2OCuSO45H2OCoCl26H2O0.830.250.0250.0258302502525铁盐Na-EDTA37.33730FeSO47H2O27.81002780100010维生素和烟酸0.525氨基酸甘氨酸2.0100Vit.B10.11005100010Vit.B60.525肌醇1005000(1)MS大量元素母液的配制按照MS培养基配方的用量扩大20倍，将大量元素配制成20倍的母液。配制时先用量筒量取蒸馏水800ml，放入1000ml的烧杯中，依次分别称取KNO338g;NH4NO333g,MgSO47H2O7.4g,KH2PO43.4g,CaCl22H2O8.8g，按顺序先后倒入烧杯中，用玻璃棒搅动，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一

3、种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶，用蒸馏水定容至1000ml,然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于C冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为50ml。(2)MS微量元素母液的配制将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大1000倍，用电子天平分别依次称取MnSO44H2O22.3g，ZnSO47H2O8.6g,H3BO36.2g，KI0.83g，Na2MoO42H2O0.25g，CuSO45H2O0.025g，CoCl26H2O0.025g，并用重蒸水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入1000ml倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于C冰箱保存备用。配制培养基时每升MS培养基吸取该母液量为1ml。(3)铁盐母液的配制在电子天平上准确称量2.78g硫酸亚铁(FeSO47H2O)和3.73g乙二胺四乙酸钠(Na-EDTA)分别倒入盛有400ml蒸馏水的烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶解。将两种溶液倒入同一个1000ml的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容至1000ml,并

4、倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于C冰箱保存备用。如果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中。则会容易形成沉淀。配制培养基时，每配制MS培养基吸取此母液。（4）MS有机母液的配制用电子天平依次称取：肌醇（环己六醇）5000mg,盐酸硫胺素（维生素B1）5mg,烟酸25mg,甘氨酸100mg，盐酸吡哆醇（维生素B6）25mg,用蒸馏水依次溶解并定容后，装入500ml的磨口瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于C冰箱保存备用。配制培养基时，每配制培养基吸取该母液。（）植物生长物质母液的配制母液：准确称量。先用乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容；也可以用少量碱（如氢氧化钾、氢氧化钠）溶液，使之中和成为钠盐或钾盐，在水中溶解，再加水定容至，即配成浓度为的母液。贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放入C冰箱保存。母液的配制过程与相同。（2）6-BA母液：准确称量50mg6-BA,加入少量碱溶液（如氢氧化钾、氢氧化钠）或稀碱液（盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容至，即配制成浓度为的的母液。转入磨口试剂瓶中，并贴上标签

5、，注明母液名称、浓度和配制日期，放入C冰箱保存备用。五、注意事项在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺序，尽量把Ca2+,SO42-,PO43-等离子错开分别溶解，同时稀释浓度要大些，并要慢慢地边混合边搅拌。实验一MS培养基的配制与灭菌一、实验目的：学习用母液法配制MS培养基以及掌握培养基灭菌的方法及操作过程。二、实验原理:组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质,同时也是各种细菌、真菌滋生繁殖的极好场所。因此必须对培养基进行灭菌处理,一确保无菌操作的顺利进行。三、实验器材及试剂： 器材：电子天平、托盘天平、烧杯（50ml,100ml,500ml,1000ml）、量筒（1000ml,100ml,25ml）药勺、称量纸、玻璃棒、移液管（10ml,5ml,2ml,1ml,0.5ml,0.2ml）、电炉（1000W）、石棉网、吸耳球、酸度计或pH试纸（5.07.0）、三角瓶（50ml,100ml）或果酱瓶、耐高温高压的专用封口膜、线绳、冰箱、手提式消毒灭菌锅或卧式电压力灭菌锅 试剂：蔗糖、琼脂、活性炭、1NHCl、1NNaOH；2,4-D、6BA等植物激素母

6、液及MS基本培养基母液。四、实验步骤（1）培养基的配方本次实验分成三组，每组配制一种培养基，各组所配制的培养基如下：A胡萝卜块根愈伤组织诱导培养基：MS+2,4-D（1mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L）pH60配制1-1.5L用小果酱瓶分装30-35瓶，另：需要无菌水每人两瓶（大果酱瓶）、纱布5块、碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。B香蕉芽的继代生芽培养基：MS+6BA（5mg/L）+IBA（01mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L）pH60配制2-2.5L用小果酱瓶分装60-65瓶，即每人两瓶，另：需要纱布5块、碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。C香蕉芽苗的生根培养基：1/2MS+蔗糖（30g/L）+琼脂（8g/L）+活性炭（1g/L）pH60配制1.5L用大果酱瓶分装30-35瓶，另外：纱布5块，碟子每人一个（30-35个），用报纸包好一同灭菌。（2）培养基的配制 称取母液：首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿,量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等放在相应的位置。然后，根据所需配制的培养基用量，按照下面的公式及所需

7、的各种母液的扩大倍数，分别计算需吸取各母液的数量（ml）。吸取量=需要配制培养基的体积X需要配制浓度/母液浓度 培养基定容：取1L大烧杯一只，用量筒或移液管分别吸取各母液（注：各母液移液管不能混用）。倒入500ml蒸馏水，然后准确称量琼脂及蔗糖，最后定容至1L。 调节pH值：用1mol/LHCl或1mol/LNaOH将培养基pH值调节至5.86.0。用酸碱调节pH值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH试纸或pH计测试培养基的pH值。然后放在电炉或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化。 分装：将培养基分装入相应的果酱瓶中，每瓶大约2030ml,盖上盖子，贴上标签。用记号笔注明培养基名称、配制时间及配制者姓名，待灭菌用。 培养基的灭菌：把分装好的培养基及其他需灭菌的各种器具和蒸馏水等，放入灭菌锅的消毒桶中，放入锅中。（3）培养基的灭菌：利用卧式高压灭菌锅的灭菌步骤，整个过程大概需要2个小时，按以下步骤操作： 设定压力为0.11Mpa，温度为12C 三开（开出气阀、进水阀、外红阀） 注水（开水龙头）至离进水显示柱高端1cm左右 三关（关出气阀、进水阀、外红阀） 打开电源开关，通电 夹层压力在0.1Mp

8、a以下可以将培养基和无菌水等需要灭菌的物品放入灭菌室 夹层压力达到0.1Mpa时打开夹层与灭菌室的开关 夹层与灭菌室同事升温升压，如停止不升温可以手动打开放气阀再放气分钟，待冷空气全部排净就可以升温升压，待达到0.1Mpa、12C时，灭菌锅会自动保温不会继续升温与升压，这时开始计时分钟，（培养基灭菌需要分钟、无菌水需要分钟） 时间到，关闭电源，可以慢慢打开出气阀放气 待温度与压力下降，80C以下时可以将培养基与无菌水等移出灭菌锅备用五实验结果：一周后观察试验结果，描述培养基是否凝固及状态、颜色，如果实验失败（培养基不凝固）请分析原因，并自己找时间重新配置。结果：凝固；胶体态；半透明状。六思考题：1培养基配置过程中应注意哪些因素？培养基为什么要煮沸后再分装？答：培养基配制过程中应注意PH和灭菌；PH影响外植体和培养材料对离子的吸收，过酸过碱的培养基影响培养材料的生长；此外，琼脂培养基的PH值还影响到培养基的凝固状况。灭菌，植物组织培养必须在无菌环境中进行。培养基煮沸后再分装的原因：因为含琼脂的培养基会在40。C左右时凝固，因为要先在水浴中加热，使其成为均匀液态时在尚未冷却情况下尽快分装。

9、2.调节pH值应该调高0.2-0.3个单位，为什么？答：因为在高压蒸汽灭菌过程中，培养基中的某些成分会发生分解货氧化，常使培养基的PH值发生一定幅度的变化（PH值常下降约0.10.5个单位），PH值变化的方向和幅度取决于多种因素，如培养基成分、浓度、灭菌时间及温度等，因此在设定培养基PH值时应根据实际情况做适当调整。3什么因素影响培养基的凝固？灭菌锅的应用应该注意哪些方面？答：琼脂质量太差或者计算量错误；PH值过酸；灭菌操作参数等因素影响培养基的凝固。灭菌锅的应用应注意：锅中应放足量的水培养容器要平放，不要过度倾斜灭菌锅密闭前，应将冷空气充分排空随时观察压力及温度情况，保持压力恒定，当压力达到时要严格控制时间15min灭菌完毕后减压不要过猛，压力表回归个位后才可打开盖或门。实验二外植体的消毒及其愈伤组织的诱导一、实验目的：通过实验，初步掌握外植体材料的消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织的诱导方法。二、实验原理：植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体植物器官或组织、甚至单个细胞的过程，如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去

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