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蛋白酶酶活测定方法福林法

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1、蛋白酶酶活的测定方法福林法1. 酶单位定义：1g 固体酶粉或1mL液体酶，在一定温度和 pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以 u /g u/mL表示。2. 原理蛋白酶在一定温度和 pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，在碱性条件下，将福林试剂Folin 复原，生成钳蓝和鸨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。3. 试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000ml磨口回流装置中加入鸨酸钠NaWO2H2。100g,钳酸钠NaMoO2H2。25g,水 700mL 85喇酸 50mL 浓盐酸 100mL 小火沸腾回流10h,取下回流冷却器，在通风橱中参加硫酸锂LiSO4 50g，水50mL和数滴浓漠水99%，再微沸15min,以除去多余的漠冷却后仍有绿色需要再参加漠水，再煮沸除去过量的漠，冷却，加水定容至 1000mL,混匀，过滤。制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。3.2 碳酸钠溶液 c NaCO =0.4mol/L称取无水碳酸钠N&CO 42.4g，加水溶解并定容至 1000ml.3.

2、3 三氯乙酸 c CChCOOH =0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至 1000ml.3.4氢氧化钠溶液 c NaOH =0.5mol/L按GB601配制。3.5 盐酸溶液 c HCl =1mol/L 及 0.1 mol/L按GB601配制。3.6缓冲溶液a. 磷酸缓冲液pH=7.5,适用于中性蛋白酶。称取磷酸氢二钠N&HPO.12H2。6.02g和磷酸二氢钠NaHPO. 2H2O 0.5g ,加水溶解并定容至1000ml.b. 孚L酸缓冲液pH=3.0,适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸80%90% 10.6g，加水溶解并定容至 1000mL乙液称取乳酸钠70% 16g,加水溶解并定容至 1000ml.使用溶液取甲液8mL乙液1mL混匀，稀释一倍，即成 0.05mol/l乳酸缓冲溶液。c. 硼酸缓冲溶液pH=10.5,适用于碱性蛋白酶。甲液称取硼酸钠硼砂19.08g，加水溶解并定容至 1000mL乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至 1000mL使用溶液取甲液500ml,乙液400ml.,混匀，用水稀释至 1000mL。3.7 10g/l 酪素溶液称取酪

3、素10.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液假设酸性蛋白酶那么用浓乳酸23滴湿润后，参加适量得各种适宜 pH值的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入1000mL容量瓶，用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。3.8 100 g/mL L-酪氨酸标准溶液a. 称取预先于 105C枯燥至恒重的 L-酪氨酸0.1000g，准确至0.0002g，用1 mol/L 盐酸 60mL溶解后定容至100mL即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b. 吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液 10.00mL,用0.1mol/l 盐酸定容至100mL即得100 g/mL L- 酪氨酸标准溶液。4仪器和设备4.1恒温水浴40 C 0.2 Co4.2分光光度计应符合GB9721的规定。5分析步骤5.1标准曲线的绘制a. L-酪氨酸标准溶液：按表A3配制。表A32 P.吕亏酪氨酸标准溶液的浓度g/mL取100 g/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL取水的体积mL000101101922028330374404655055b.分别取上

4、述溶液各 1.00mL须做平行试验，各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL,福林试剂使用液1.00mL,置于40C 0.2 C水浴中显色 20min,用分光光度计于波长 680nm 10mnt匕色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线曲线应通过零点。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量g,既为吸光度常数K值。其K值应在95100范围内。5.2测定1待测酶液的制备a.称取酶粉12g,精确至0.0002g 或取液体酶1.00mL,用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒搅拌捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣局部再参加少量缓冲液，如此捣研 34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀。通过四层纱布过滤，滤液根据酶活力再用一次缓冲液稀释至适当浓度，供测试用稀释至被测试液吸光值在 0.250.40 范围内。b.酶粉测定时，稀释倍数参考表4 液体酶液可参照表 4稀释。酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释2万20002g 200mL 100 倍5m 100mL 20 倍3万25002g 500mL 2

5、50 倍5m 50mL 10 倍4万40002g 200mL 100 倍5m200mL 40 倍5万50002g 500mL 250 倍5m 100mL 20 倍8、10 万100002g 500mL 250 倍5m200mL 40 倍(2)测定a先将酪素溶液放入 40C 0.2 C恒温水浴中，预热 5min。b按以下程序操作于660nm波长，用10mmt匕色皿测其吸光度c. 1.398和166蛋白酶，除反响与显色温度为30 0.2 C外，其他操作同 5.2 ,标准曲线也作同样处理。5.3 计算 X=Ax Kx 4/10 x n=2/5 x Ax n式中，X一样品的酶活力，u /g (u/mL);1样品平行试验的平均吸光度；K吸光常数(K=97.09实验室测定值)4反响试剂的总体积，mL;10反响时间10min,以1min计；n一稀释倍数5.4结果的允许差平行试验相对误差不得超过3%需要准备的：基皮，面粉，水，纱布，福林试剂，250ml三角瓶，每组10- 15支试管，分光光度计，三氯乙酸，磷酸缓冲液或水，碳酸钠溶液，酪素，已传代好的试管斜面。最好能镜检一下真菌菌丝的形态。试管A 空白加酶液1.00ml40+0.2 C ,预热 2min加三氯乙酸2.00ml摇匀40+0.2 C ,保温 10min加酪素1.00ml,摇匀取出静置10min,过滤取1.00ml滤液加碳酸钠溶液 5.00ml加福林试剂使用液1.00 ml40+0.2 C ,显色 20min试管B 酶试样，需作三个平行加酶液1.00ml40+0.2 C ,预热 2min加酪素1.00ml,摇匀40+0.2 C ,保温 10min加三氯乙酸2.00ml摇匀取出静置10min,过滤取1.00ml滤液加碳酸钠溶液 5.00ml加福林试剂使用液1.00 ml40+0.2 C ,显色 20min

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