《AGE电泳基础》word版
6页1、【电泳基础】聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基:这样由于乙烯基”CH2=CH”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链,同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联,从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用,所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。?丙烯酰胺的另一种聚合方法是光聚合,催化剂是核黄素,核黄素在光照下能够产生自由基,催化聚合反应。一般光照23小时即可完成聚合反应。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制
2、,丙烯酰胺的浓度可以在330之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径,如3的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离DNA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如1020的凝胶常用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶,如图216。 图216 聚丙烯酰胺的凝胶网络聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T 和C,T 是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C 是与T 有关的交联百分浓度。T 与C 的计算公式是:上式中a 为丙烯酰胺的克数,b 为甲叉双丙烯酰胺的克数,m 为水或缓冲液体积(mL)。式中a 与b 的比例很重要。富有弹性,且完全透明的凝胶a 与b 的重量比应在30左右。选择T 和C 的经验公式是:C = 6.50.3T此式可用于计算T 为520时的凝胶组成。C 值并不很严格,在大多数情况下,可变化的范围约为 1,当C 保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T 的增加而减小,当T 保持恒定,C 为4时,有效孔径最小,C 大于或
3、小于4时,有效孔径均变大,C 大于5时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C 是2.6和3.0。配成30的丙烯酰胺水溶液在4下能保存1个月,在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂,操作时要避免直接接触皮肤,但它们聚合后则无毒。聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点,因而四十年来得到广泛的应用,目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有:可以随意控制胶浓度”T”和交联度”C”,从而得到不同的有效孔径,用于分离不同分子量的生物大分子;能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中,达到更高的灵敏度:109 1012 mol/L;由于聚丙烯酰胺凝胶是由CC键结合的酰胺多聚物,侧链只有不活泼的酰胺基CONH2 ,没有带电的其他离子基团,化学惰性好,电泳时不会产生”电渗”;由于可以制得高纯度的单体原料,因而电泳分离的重复性好;透明度好,便于照相和复印。机械强度好,有弹性,不易碎,便于操作和保存;无紫外吸收,不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析;还可以用作固定化酶的惰性载体。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳天然聚丙烯酰胺凝
4、胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷,它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用,因而可以得到较高的分辨率,尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性,对于生物大分子的鉴定有重要意义,其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳,电泳后将凝胶切成两半,一半用于活性染色,对某个特定的生物大分子进行鉴定,另一半用于所有样品的染色,以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的,玻璃管通常直径为7 mm,长10 cm,将凝胶装入到多个管中进行电泳,又称为柱状电泳。目前仍有应用,尤其用于二维电泳中的第一维电泳。但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异,所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品,电泳过程中样品所处的条件比较一致,样品间可以进行更好的比较,重复性也更好,所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛,常用于蛋白质及DNA 序列分析过程中DNA 片段的分离、鉴定。水平平板电泳近年来也有很快的发展,与垂直平板电泳相比也有其独特的优点:由于凝
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