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噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌空泡毒素VacA基因结合蛋白
4页1、噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)基因结合蛋白 【关键词】噬菌体展示;幽门螺杆菌;空泡毒素(VacA);结合蛋白 0引言 我们应用噬菌体展示技术,以幽门螺杆菌(HelicobacterPylori,Hp)VacA基因片段作为固相筛选分子,筛选幽门螺杆菌VacA基因结合蛋白,探索VacA致病机制,研究VacA致病机制,为HP疫苗的研制和治疗等提供依据. 1材料和方法 1.1材料 T7select人胃细胞cDNA文库,受体菌BLT5615(Novagen公司),质粒pGEMTeasy(Promega公司),Taq酶、琼脂糖,dNTP,T4连接酶、RNA酶,玻璃奶DNA回收试剂盒(博大科技),BamHI,SacI等限制性内切酶(购于宝生物公司),热循环仪、凝胶成像仪、大肠杆菌DH5为本实验室保存,引物合成与核苷酸序列分析由大连宝生物公司完成. 1.2方法 1.2.1Hpvaca基因扩增1采用PrimerDesigner引物设计软件设计,大连TaKaRa公司合成.在上下游引物的5端分别引入BamHI,SacI限制性酶切位点,其中上游引物5端用生物素标记.上游引物:5TTGGATC
2、CGAAATACAACAAACACACCT3,下游引物:5AAGAGCTCAGATTTTTGGAAACCACCTT3.产物回收纯化. 1.2.2文库扩增摇菌BLT5615至A600nm值0.5,加入IPTG,30min后加入噬菌体文库4L,37振摇直到细菌裂解,将裂解液4保存. 1.2.3生物筛选链亲和素包被微孔板,4过夜;1TBS洗涤,加入vacA基因回收片段,4过夜;1TBST洗涤,加入文库扩增裂解液,4过夜;1TBST洗板,加入200LT7洗脱缓冲液,手摇室温孵育20min,取10L洗脱噬菌体加入3mLBLT5615细菌培养液,37振摇培养,直到细菌裂解.收集裂解液4离心取上清4保存备下一轮筛选用.按上述步骤再筛选3遍.第二、三、四轮筛选分别以前一轮的裂解液代替文库扩增裂解液,每轮筛选后,均做噬斑分析. 1.2.4噬斑的PCR扩增取第4轮筛选后的阳性噬斑,进行噬菌体裂解,将噬斑裂解液PCR扩增,上游引物:5GGAGCTGTCGTATTCCAGTC3;下游引物:5AACCCCTCAAGACCCGTTTA3.扩增条件:94变性60s,50退火55s,72延伸60s,循环35次后,72
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