细胞工程在环境治理中的应用

1、细胞工程在环境治理方面的应用摘要：细胞工程与基因工程一起代表着生物技术最新的发展前沿,伴随着试管植 物、试管动物、转基因生物反应器等相继问世,细胞工程在生命科学、农业、医 药、食品、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。本文简要介绍了细胞工程 的基本概念及其在环境治理中的应用状况,并对其应用前景提出展望。 关健词：细胞工程，细胞融合技术，细胞培养，细胞固定化，环境治理一、细胞工程概论细胞工程即是在细胞水平上应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和 技术,按照人们的要求,有计划地大规模培养组织和细胞以获得生物极其制品,或 以改变细胞的遗传组织或以生产新的品种的工程。围绕着生命活动这一中心,基 因工程研究的是分子水平上 DNA 的复制和遗传信息的表达、蛋白质的合成等;细 胞水平上的细胞工程研究的是细胞的增殖、分化、死亡;而个体水平上的研究则 是遗传和发育。与基因工程相比,除被转移物质和转移方法不同外,在带有遗传信 息的物质的选择、驯化、鉴定等方面二者基本相同;而细胞工程所要求的技术条 件、实验设备以及经费等均比基因工程要求低一些,尤其是在人们对基因工程的 安全性尚未给出确定的回答之前,细胞

2、工程的价值格外受到重视。细胞工程的主 要技术和应用川包括组织和细胞的培养技术,细胞的融合技术,细胞器移植技术, 体外受精技术,物理、化学技术等。目前在环境治理中应用较多的是细胞培养技 术,细胞的融合技术及物理、化学技术。（一）细胞培养技术细胞培养技术包括微生物的培养、植物细胞培养以及动物的组织与细胞培 养。微生物的培养主要是指微生物营养结构的研究以及培养方法的研究,其目的 是提供用于研究或生产的微生物菌种。植物细胞培养包括植物器官、组织、细胞、 原生质体、胚和植株的培养。它是在植物组织技术基础上发展起来的,是指在离 体条件下培养植物细胞的方法。与天然植物栽培相比,植物细胞培养因具有如下 特点可能会成为能够解决有用代谢物长期供应问题的非常有希望的手段。: （二）细胞融合技术细胞融合（cellfusion ）,是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞, 使一个细胞的遗传物质包括细胞核 DNA 和核外基因都进人另一个细胞。它是继转 化、转导和接合之后一种更有效转移遗传物质的手段。细胞融合技术能克服遗传 障碍,实现远源杂交,构建集双亲优良遗传性状于一体的融合子,创造有应用前 景的生物s。其整

3、个过程包括:遗传标记筛选、原生质体的制备、融合与再生、 融合子的鉴定。1. 遗传标记的筛选融合子的筛选是融合过程中的关键。目前采用的亲本遗传标记和筛选主要有 下列几种方法。其一为营养缺陷型标记，即融合的双亲为营养缺陷型且为不同的 缺陷型(单缺或双缺)，双亲缺陷的原生质体融合后于基本培养基上选择融合子。 只有营养缺陷得到互补后的融合子才能恢复生长，亲本不能在基本培养基上生 长。其二为抗药性标记，即利用菌种对药物的抗性存在差异。其三是利用荧光色 素标记，在荧光显微镜下用显微操作挑出具有双亲两种荧光色素单细胞即为融合 子。其四为失活原生质体供体法。其余尚有温度敏感型、糖发酵和同化性能、呼 吸缺陷和形态等亲本标记选择方法。在实际应用中也有将上述某些方法结合起来 使用，如营养缺陷型与抗药性、抗药性与灭活等。2. 原生质体制备与再生 根据细胞壁的不同结构与组成，菌体的处理方法不同。在制备细菌、放线菌 的原生质体时，主要使用溶菌酶，其中革兰氏阳性菌(G)用溶菌酶处理，革兰 氏阴性菌(G)用溶菌酶加乙二胺四乙酸钠(EDTA)处理。对于酵母、霉菌、大型 真菌、植物，由于其细胞壁组成更为复杂，常用纤维素酶

4、、蜗牛酶、几丁质酶等 复合酶处理。原生质体的制备过程中受影响的因素主要有培养基成分、培养方法、 菌龄、酶浓度、酶处理温度与时间、 pH 值、渗透压稳定剂等。制备的原生质体 已经失去细胞壁，仅有一层厚约 lOnm 的细胞膜，它具有生物活性，但不是正常 的细胞，在普通培养基上不能生长，必须涂布于再生培养基上，使之再生为正常 的细胞。再生培养基需补加两类物质:一类是蛋白质、糖类或氨基酸等营养因子; 另一类是渗透压稳定剂，如蔗糖(或甘露醇)、T二酸钠、KC1, Mgz 等。3. 原生质体融合1974 年，匈牙利的 Ferenc z yb 采用离心力诱导的方法报道了白地霉 ( Geotrichumcandidum ) 的营养缺陷型突变株的原生质体的融合。随后人们相继 用NaCI , KCl和Ca ( N03 )等作为诱变剂进行融合，但融合频率都很低。同 年Ka。发现PEG在适量Cap 存在下能有效地诱导植物原生质体融合，从而使这 一技术跃上了新的阶段，大大提高了融合频率。PEG多采用分子量4000和6000 两种，Hopwood 研究认为这两者融合的效果差别不大。融合率还受PEG和阳 离子的浓度

5、、诱导融合时间、pH值等因素的影响。林红雨等a采用在融合液 中添加新生磷酸钙的方法可以促进原生质体融合。在融合方法上，除了化学因子 诱导融合外，电场诱导、激光诱导细胞融合的新技术，进一步提高了融合频率。4. 融合子的鉴定在再生培养基上再生出的标记得到互补的菌落，我们可以初步判定它是融合 子。由于这样检出的融合子中，还有部分杂合子、部分二倍体、异核体的存在， 所以要对检出的融合子做进一步的鉴定。鉴定工作一般从形态学、生理生化性质、 生物量、遗传学(基因型、DNA含量、GC比值)和同工酶等几个方面进行。近年来， 也有人通过DNA限制性内切酶酶切片段的比较、核甘酸序列分析、分子杂交RAPD 技术等分子生物学方法来鉴定融合子。到目前为止，虽然关于融合子中双亲株遗 传物质重组的分子机制还不很明确，但有些问题人们已形成共识:原生质体 融合后的细胞处于暂时的二倍体（或多倍体）状态，之后有两种可能:一是染色体 DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于1个细胞内，形成异核体，这是不稳 定的融合子;另一类是两亲株的整套基因组（包括细胞核、细胞质）相互接触，染 色体DNA发生多位点交换产生真正的同源重组，

6、从而产生各种各样的基因组合， 获得多种类型的重组子，通过连续传代分离纯化可以将这两类融合区分开。另外， 融合后染色体的重组是随机的种属间细胞对异源 DNA 的限制作用及染色体 DNA 的非同源性，仍是融合的一大障碍。（ 三 ） 固定化细胞技术固定化细胞技术（简称 IMC ），也叫固定化微生物技术，是指通过化学或物 理手段，将筛选分离出的适宜于降解特定废水的高效菌株，或通过基因工程技术 克隆的特异性菌株进行固定化，使其保持活性并反复利用!“一川。固定化细胞 有细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、运转费用低、维护 管理简单和剩余污泥少等优点，因此，固定化细胞技术已越来越受到人们的重视。按照固定载体与作用方式不同，固定化细胞的制备方法可分为 3 种类型:吸 附法、包埋法和交联法。吸附法（载体结合法）通过物理吸附、化学或离子结合的方法，将细胞固定在 非水溶性载 体上。该方法操作简单，细胞活性损失小，载体可反复使用，但所能固定的细胞 数量有限，细胞和载体结合不牢，易脱落。废水处理中的生物膜法是其代表性例 子。包埋法是使细胞扩散进人多孔性载体内部或将细胞包裹在凝胶网格结构中 或半透

7、性聚合薄膜内，小分子的底物和产物可以自由扩散，而细胞却不会扩散到 周围介质中去。该法操作简单，对细胞活性影响小，制作的固定化细胞球强度高， 是目前研究最广泛的固定化方法，但包埋材料会一定程度阻碍底物和氧扩散，并 对大分子底物不适用。交联法（架桥法）是不用载体的，它利用两个以上功能团试剂，直接与细胞表 面的反应基 团如氨基轻基等进行交联，形成共价键来固定细胞。此法化学反应条件剧烈，对 细胞活性影响大，实际常与其他方法结合。聚集一交联固定法是使用凝聚剂将菌 体细胞形成细胞聚集体，再利用双功能或多功能交联剂与细胞表面的活性基团发 生反应，使细胞彼此交联形成稳定的立体网状结构。这样，高效菌体不易流失， 生物浓度高，而提高了处理效果iz0二、细胞工程在环境保护中的应用( 一 ) 植物细胞培养用于可降解塑料的生产利用植物本身作为生物反应器进行次生代谢产物的生产，发挥植物的生物合 成能力，为人类生产出人类所需的原料，业已成为一颇具前途的新领域，现在已 经有多种物质可以用培养转基因植物进行生产，例如利用植物可以进行可生物降 解塑料的生产。聚经基烷醋(PHA)是一种可以用来制备可生物降解塑料的单体原 料

8、。以乙酞一 CoA为前提合成的，现在主要用微生物发酵法进行生产。自从 1992 年美国科学家首次进行了植物生产 PHB 的尝试 ”后， Somerville、小组于1994年改进了策略，将PHB定位于质体ya.u;。英国Zenica 公司将 phbA, phbB, phbC 基因导人了油菜，利用 Rubisco 小亚基转运肤将三个 基因定位于叶绿体中表达，提高了产量。美国 Monsanto 公司的科研人员正在同 时进行转基因油菜和大豆生产PHB的研究。德国Trethewey利用，今铃薯在块茎 的胞质和线粒体中合成PHB6 o Padgett。等to 1在研究转基因植物生产PHB 的同时将植物生产共聚物PHBV也摆上了日程。利用环基因植物进行PHA的生产 可以极大地降低成本，从而有利于推广可生物降解塑料的生产和使用。(导) 细胞融合技术构建环境治理工程菌1 纤维素降解菌原生质体融合和沼泽红假单抱菌在 PEC 催化下得到光合细菌 种间融合子19J。其融合子对降解底物中COD的能力优于任一亲本菌株，表现出 高效降解、利用有机污染物的优势。随后对光合细菌球形红假单胞菌 P9479 (NtrSm

9、s)与酿酒酵母Y9407 (NtsSms)的融合细胞Fo。和Fzl的性能研究zap表 明:两融合子耐酸性能与酿酒酵母相似；Foa耐热性近与酿酒酵母，Fzl的耐热性 近与球形红假单胞菌.在 B. Braun 反应器中，融合子 Fzl 的观测产率系数 Yobs 和菌体产量AX高于球形红假单胞菌;对废水中污染物BOD,的去除率E和容积负 荷U在底物浓度BOD，为4b00m岁L时均优于双亲;融合子Fzl的生物负荷Ub 和菌体比降解率9高于酿酒酵母，絮凝效率P优于任一亲株。融合子在多方面综 合了双亲菌株优势，可见将原生质体融合技术引人废水资源化处理的应用领域具 有良好前景。4. 利用细胞融合技术构建抗污染型植物工业革命以来，人类活动特别是工业活动造成了严重的环境污染。当生物群 落受污染物胁迫时，不同物种的适应性反应不可能完全相同，某些物种因无抗性 基因而被淘汰。有研究表明由于大气高浓度SO，的影响，美国俄亥俄州北部白 松群体至少有 40%的种质已丢失 ”一。熏蒸实验和野外调查表明，在颤杨 (Populustremuloides)和红械(Acerrubrum)中也有类似的情况！污染胁迫的最显著效应是消除敏感物种或个体，改变生物群落的物种构成。 研究表明，污染胁迫导致植物居群进化。矿山和冶炼厂污染区出现抗重金属生态 型“。农业杂草中发现抗除草剂进化 ”抗气体污染物进化也有若干报道!w1。 在研究过的实例中，除少数例外，抗污染性均表现为可遗传性状，而目前关于抗 污染特性的遗传基础仍然研究得不充分!”，所以我们可以利用细胞融合技术的 优势，将抗污染性植人其他植物体内以保证该物种对环境污染良好的适应性。美 国纽约州厄普顿 Brookhaven 国家实验室的微生物学家 Daniel van der Lelie 和比利时林堡大学中心的环境生物学家 aco Vangronsveld 领导的研究小组发 现，向植物中注射一种细菌的菌株能够使植物降低甲苯致病的能力。于是研究人 员采集了一种通常存在于黄羽扁豆内部的细菌，这些无害的细菌多位于细胞的表 面，并且将它们与那些具有降解甲苯能力的细菌进行原生质融合，结果本地的黄

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