蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

1、蛋白 FITC 标记及葡聚糖凝胶柱使用荧光素 FITC 标记抗体纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。 有两种异构体， 其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。当FITC 在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r 氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成 FITC- 蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个 IgG 分子中有 86 个赖氨酸残基， 一般最多能结合 15 20 个，一个 IgG 分子可结合 28 个分子的 FITC，其反应式如下 :FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 FITC -NS-C-N-H2- 蛋白质FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质 例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记步骤：(1) 试剂和材料 001molL(pH72)PBS 配法中，校定 pH至 72。NaCI18g、 Na2HP04 1 15g，溶于 2000ml 蒸馏水01molL(pH90) 碳酸盐缓冲液配法 取 05molLNa2CO3(5 3)

2、10ml加入 05molLNaHC03(4 2)90ml ，混合后，校定 pH至 90。3碳酸钠水溶液配法称 5g 无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。其他试剂和材料 l 叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯 (25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯 (500m1)透析袋等。(2) 方法及步骤 取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清， 分离球蛋白，用盐水(0 15molLNaCl) 及缓冲液 (0 5molLNaHC03 Na2C03，pH90) 稀释使每毫升内含蛋白质 1-5mg，缓冲液为总量的10，降温至 4。加入异硫氰酸盐 (FITC) 荧光素 蛋白：荧光素 (50 80)mglmg ，在 04下电磁搅拌 12 14h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素， 再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵( 用 Nessler 试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止 ) 。将制备好的荧光抗体加叠氮化钠0.01 ，分装在 lml 安瓿中，或冻干，保存于冰箱中 (4 ) 可以用半年以上， -20 保存可达 2 年以上。4透析标记法此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记

3、简便，非特异性染色较少。(1) 试剂和材料 试剂和材料同改良法。(2) 方法及步骤 用 0025molL 碳酸盐缓冲液 pH90，将欲标记免疫球蛋白稀释成 1浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将 FITC 配成 0 1mgml 的溶液，按 10mgml 球蛋白溶液体积的 10 倍，将 FITC 稀释液盛于圆柱形容器内， 并使透析袋浸没于 FITC 液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在 4C电磁搅拌下透析标记 24h。取出透析袋中标记液，即刻用 SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4中。FITCCAS#：3326-32-7中文名： 异硫氰酸荧光素英文名： Flourescein iso-thiocyanate； FITC结构式：分子式： C21H11NO5S分子量： 389.38性质：1. 外观：黄色粉末2. 纯度： 95% (HPLC)3. 产品描述：FITC 能和各种抗体蛋白结合， 结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液 中具有强烈的黄绿色荧光。 通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、 定位或定量的检测。 最大吸收光波长为

4、490 495nm，（黄绿光范围）最大发射光波长为525 530nm. （黄光范围）4. FITC 标记抗体流程：（ 1）将待交联的蛋白（浓度 2mg/mL）对交联反应液透析三次 4 ，至 pH9.0 。交联反应液配制方法： 7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36gNaCl ，加水定容至 1L。（ 2）将 FITC 溶于 DMSO中，浓度为 1mg/mL。每次交联使用的 FITC 均应新鲜配制，避光。（ 3）按 P:F（蛋白质 :FITC ）=1mg:50g 的比例将 FITC 缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处 4 反应 8 h 。（ 4）加入 5mol/L 的 NH4Cl 至终浓度 50mmol/L（稀释 100 倍），4终止反应 2 h。（ 5）将交联物在 PBS中透析四次以上，至透析液清亮。（ 6）交联物的鉴定蛋白浓度 (mg/mL) = A2800.31 A495 / 1.4F/P 比例 : 3.1 A / A280 0.31 A ，该值应介于 2.5 6.5之间。495495（ 7）FITC 交联的蛋白应置于 pH 7.4 的

5、磷酸盐缓冲液中，加入 0.1% NaN3、1%BSA，4避光保存。储存条件 ：4避光保存实验要点及说明：偶联反应要求在尽可能接近pH9.8 的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此 pH 水平； FITC 与蛋白质的比值（ F/P）, 可通过测定 495nm与 280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为 0.3 1.0 ； FITC 唯一的缺限是易被光淬灭， 因此复合物必须始终避光保存； 如果 FITC复合物对 PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰。1. Prepare a solution of at least2 mg/ml of protein in 0.1 M sodium carbonate buffer, pH 9.Notes: Do not store sodium carbonate-bicarbonate buffer more than 1 week at 0-5C. The pH of the buffer may change upon storage. It is advised that fresh buffer be made just

6、 before use.The protein to be conjugated should be free of contaminating proteins, and protein solutionsshouldnot be prepared in buffers containing sodium azide oramines such as Tris or glycinesince they inhibit the labeling reaction.Ifthe buffercontains amines or sodium azide, dialyze protein solution against PBS, pH 7.4,overnight at 0 - 5 C. Avoid dialysis at high pH values ( 8.0-8.5) as this may beharmful to some proteins. 要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与 FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC 的偶联率）2. Dissolve

7、 the FITC in anhydrous DMSO at 1 mg/ml.将 FITC溶于 DMSO中，浓度为 1mg/mL。每次交联使用的 FITC均应新鲜配制，避光。Note: This should be prepared fresh for each labeling reaction.3. For each 1 ml of protein solution, add 50l of FITC solution, very slowly in 5 ml aliquots while gently and continuously stirring the protein solution.按 P:F（蛋白质 :FITC ） =1mg:50 g的比例将FITC 缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 反应 8 h 。4. After all the required amount of FITC solution has been added, incubate thereaction in the dark for 8 hours at 4 C.5.

8、Add NH4Cl to a final concentration of 50 mM and incubate for 2 hours at 4 C.加入 5mol/L 的NH4Cl 至终浓度 50mmol/L， 4终止反应 2 h 。6. Add xylene cyanol to 0.1% and glycerol to 5%.7. Separate the unbound FITC from the conjugate by gel filtration using a fine-sized gel matrix with an exclusion limit of 20,000 to 50,000 (for globular proteins such as antibodies). With the column flow stopped, carefully layer the reaction mixture ontothe top of the column. Then open the column, allowing the reaction mixture to flow into the column. Just as it all enters the column bed, carefully add PBS to the top of the column and connect to a buffer supply. Two bands will form on the column. The faster moving band, which i

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