总氮量的测定-微量凯氏定氮法
5页1、实验一 蛋白质的定量分析总氮量的测定一微量凯氏定氮法一、实验目的1. 学习微量凯氏定氮法的原理;2. 掌握微量凯氏定氮法的操作技术,包括标准硫酸铵含量的测定,未知样品的 消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。二、实验原理天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。生物材料的含氮化合物分 析测定主要是指蛋白质,核酸的含量通常是用定磷法或别的方法测定。蛋白质的 含氮量几乎是恒定的,约在1516 %之间。因此只要测定蛋白氮,乘以6.25,即 为粗蛋白质含量。当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时,其中的碳、氢元素转变成CO2 和H20,而氮元素转变成氨,并进一步与硫酸反应生成硫酸铵,此过程称为“消 化”消化时分解反应进行得很慢,需要加入硫酸钾以提高沸点(可由290C提 高到400C),加入硫酸铜作为催化剂(其他氧化剂如H2O2也可)。消化完成后, 在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液,使硫酸铵分解放出氨。用水蒸气蒸馏法, 将氨蒸入过量标准无机酸(硼酸)溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,从而 计算出含氮量。以甘氨酸为例,该过程的化学反应如下:CH2COOH + 3H2SO4-2CO2 + 3SO2
2、+ 4H2O + NH3NH22NH3 + H;2SO4-(NH4)2SO4(NH4)2SO4 + 2NaOH-2H2O + Na2SO4 + 2NH3 T3NH3 + H3BO3(NH4)3BO3(NH4)3BO3 +3HCIH3BO3 +3NHQ本法适用范围为0.21.0 mg氮,相对误差小于2%。三、试剂和器材试剂:1. 浓硫酸2. 粉末硫酸钾-硫酸铜混合物(K2SO4: CuSO4 5H2O=3 : 1)3. 30% NaOH 溶液4. 0.010 mol/L 盐酸5. 2 %硼酸6. 混合指示剂:由50 ml 0.1%甲烯兰酒精溶液与200 ml 0.1%甲基红酒精溶液混 合而成,酸色为紫红色,碱色为绿色7. 蛋清液(用水稀释一倍)器材:1. 改良式微量凯氏定氮仪2. 消化炉3. 消化管4铁架台5. 电子天平6. 50 ml容量瓶7. 锥形瓶8. 表面皿9移液管10. 量筒11. 酸式滴定管12. 酒精灯四、实验步骤1、消化样品取2ml鸡蛋清样液(鸡蛋清原液:水=1: 1),加入到消化管中,加入1.5g的 催化剂(K2SO4: CuSO45H2O=3 : 1),后在通风橱中进
3、行操作。在消化管中加入 放入浓硫酸6ml消化至消化管内的液体呈现出澄清的浅蓝色。去除消化管,将其 冷却后定容到50mL容量瓶中。2、清洗凯氏定氮仪装置改良式凯氏定氮仪把蒸汽发生器、反应室和冷凝器几部分合为一体(图1.3), 使用前必须彻底洗涤。连接进水口与自来水管,打开水龙头。打开弹簧夹2,使 水进入夹套至稍高于出水口,关闭弹簧夹2和3,用酒精灯加热使蒸汽通过进气 口进入反应室进行洗涤,在冷凝管下口放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶, 冷凝管下端应完全浸没于液体中,洗涤12 min,观察锥形瓶中溶液是否变色, 若基本不变色,证明蒸馏器已洗涤干净。将火移开,打开弹簧夹1,从加样漏斗 加入少量蒸馏水,关闭弹簧夹1,由于夹套内温度降低使压力下降,可把反应室 内液体通过进气口吸出到夹套内。如此重复数次清洗反应室,仪器即可使用。图1.3改良式凯氏定氮仪,1,2,3弹簧夹,4加样漏斗,5进气口,6反应室,7夹套,8冷凝管,9出水口,10进水口3 标准样品练习蒸馏操作蒸馏样品和空白前,为了练习蒸馏和滴定操作,可用标准硫酸铵溶液做23 次试验。取3个锥形瓶,各加5 ml硼酸及23滴混合指示剂,溶液应
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