Survivin在膀胱移行细胞癌中的表达及与DNA倍体的相关性研究

1、Survivin在膀胱移行细胞癌中的表达及与DNA倍体的相关性研究 作者：赵瑞宁，陈福宝，杨芝红，张宁妹，师宏斌，余洋，卢冠军【摘要】 目的 探讨Survivin表达和DNA倍体分析在膀胱移行细胞癌中的临床意义及相关性。方法 分别应用免疫组化(SP)法和流式细胞术对60例膀胱移行细胞癌组织及10例正常膀胱组织进行Survivin蛋白检测和DNA倍体分析。结果 (1)膀胱移行细胞癌中Survivin的阳性表达率和DNA异倍体率均明显高于正常膀胱组织(P0.01)；(2)随着膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期的增高，Survivin阳性表达率和DNA异倍体率均明显升高(P0.05或P0.01)；(3)在膀胱移行细胞癌中，Survivin阳性表达率和DNA异倍体率呈正相关(P0.01)。结论 Survivin阳性表达率和DNA异倍体率与膀胱癌的发生、发展及预后密切相关。 【关键词】 膀胱肿瘤 Survivin DNA倍体 免疫组化 流式细胞术Abstract：Objective To investigate the expression and correlation of Survivin

2、and DNA ploidy in Bladder Transitional Carcinoma. Methods The immunohistochemistry(SP method)was used to determine the expression of Survivin in 60 cases with BTCC and 10 normal bladder tissues. At the same time the flow cytometry was used to determine DNA ploidy. Results (1)The positive expression rates of Survivin and rates of DNA heteroploid in BTCC were significantly higher than those in normal bladder tissue(P0.01).(2)The positive expression rates of Survivin and rates of DNA heteroploid in

3、creased significantly with increasing pathological grade and clinical stage(P0.05 or P0.01).(3)There was a positive correlation between the expression rates of Survivin and rates of DNA heteroploid(P0.01). Conclusion The positive expression rates of Survivin and rates of DNA heteroploid are closely associated with tumorigenesis，progress and prognosis of BTCC.Key words：bladder neoplasm；survivin；DNA ploidy；immunohistochemistry；flow cytometry肿瘤细胞与正常细胞的一个重要区别就是瘤细胞失去了节制性生长特性，而进入恶性生长状态。造成肿瘤细胞无限增殖的原因和机

4、制非常复杂，细胞周期的失控是肿瘤发生的重要原因之一，因此细胞周期调控已成为近年来研究的热门课题1。本研究应用免疫组化(SP)法和流式细胞术分别检测60例膀胱移行细胞癌组织和10例正常膀胱组织标本中凋亡抑制基因Survivin的表达和DNA倍体含量，旨在探讨它们在膀胱移行细胞癌中的临床意义及相关性。1 材料与方法1.1 一般资料60例膀胱癌标本取自宁夏医学院附属医院泌尿外科2005年9月至2007年2月住院治疗的膀胱癌患者，临床资料完整。男40例，女20例，年龄2088岁，平均59.5岁。病理均为移行细胞癌，其中复发性膀胱癌11例。病理分级级21例，级22例，级17例。TNM分期Tis-T1期24例，T2-T4期36例。病理学指标均由病理科资深医师确定。10例正常组织标本均取自非膀胱肿瘤患者的膀胱组织。1.2 试剂兔抗人Survivin多克隆抗体、即用型第二代免疫组化ElivisonTMplus广谱试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；CycleTESTTMPLUS DNA试剂盒购自美国BD公司。1.3 实验方法1.3.1 Survivin蛋白的检测采用免疫组化(SP)法，按试剂盒说明

5、书操作。所有标本石蜡切片均经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，抗原修复，滴加过氧化物酶阻断液，室温下孵育10min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，滴加一抗，室温下孵育60min，PBS冲洗，滴加聚合物增强剂，室温下孵育20min，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30min，二氨基连苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，光镜下观察并摄片。以PBS代替一抗作为阴性对照；阳性对照片以福州迈新生物技术开发有限公司所赠样片为准。1.3.2 DNA倍体分析采用流式细胞术，按试剂盒说明书操作。将组织块剪碎，PBS液清洗，溶血素处理，离心后制备成细胞悬液，调整细胞浓度(1106/mL)后，分别加入CycleTESTTMPLUS DNA试剂盒中的A液、B液，用0.05%碘化丙啶染色后，上机检测进行DNA倍体分析。1.4 结果判定1.4.1 免疫组化法结果判定Survivin以细胞浆及胞核着色，有棕黄色颗粒物质沉积为阳性。参照Carcia2等评分方法：根据免疫组化染色深度及阳性细胞数量分别计分，其中染色深度以多数细胞呈色反应为准。按染色强度将无、弱、中、强、极强分别计04分；再按阳性细胞比例将0、1%

6、25%、26%50%、51%75%、76%100%分别计04分，最后将相加得分的02、34、56、78分，分别计为-、。1.4.2 DNA倍体分析结果判定从计算机桌面菜单进入ModFit分析软件，调出获取数据进行分析，计算DI值，G0/G1期、S期、SG2/M期比值，依据DI值判定DNA倍体。判定标准：CVd/m100%(d是分布的标准误差，m是分布的平均值)，流式分析中分辨率或精确度由G0/G1峰的CV来反映。DI肿瘤细胞G0/G1期峰道数/正常二倍体细胞G0/G1期峰道数，以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含量定为2C值DI1.0，基于标准二倍体细胞的CV值在5%。即：DI=1.00.1(0.9DI1.10)为二倍体；DI=1.00.15(0.85DI1.15)为近二倍体；DI=2.00.1(1.90DI2.10)为四倍体；DI2.10为多倍体；其余DI值均为非整倍体。在计算DNA异倍体时，把近二倍体、多倍体、四倍体、非整倍体均划为异倍体的范畴。1.5 统计学方法应用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理。计数资料采用2检验，以P0.05为有统计学意义。相关性比较采用Spea

7、rman相关分析。2 结果2.1 Survivin免疫组化和DNA倍体分析结果Survivin免疫组化表达-、和见图1-4(封2)，DNA倍体分析类型见图5-9(封2)。膀胱移行细胞癌中，Survivin阳性表达率和DNA异倍体率均明显高于正常膀胱组织(P0.01)；Survivin阳性表达率和DNA异倍体率均随病理分级的升高而增高，级与、级比较，差异有统计学意义(P0.05或P0.01)，级与级间比较差异无统计学意义(P0.05)；随临床分期增高，Survivin阳性表达率和DNA异倍体率均有升高趋势，两者比较差异有统计学意义(P0.05)；初发膀胱癌Survivin阳性表达率和DNA异倍体率与复发膀胱癌比较，差异有统计学意义(P0.05)；Survivin阳性表达率和DNA异倍体率呈正相关，r0.929(P0.01)，见表1-3。表1 正常膀胱组织与膀胱移行细胞癌组织中Survivin表达和DNA倍体分析的情况（略）表2 Survivin表达和DNA倍体分析与膀胱移行细胞癌临床特征之间的关系（略）表3 Survivin表达与DNA倍体分析在膀胱移行细胞癌组织中的关系（略）3 讨论S

8、urvivin是1997年耶鲁大学的Altieri等发现的调亡抑制蛋白(IAP)家族新成员，是迄今为止发现的最强凋亡抑制因子3。Survivin能特异地与caspase-3和caspase-7结合，抑制二者的酶原转变为有活性的酶从而抑制caspase引起的细胞凋亡4。Survivin选择性的表达于常见恶性肿瘤，而在癌旁正常组织和成人分化组织(胸腺、睾丸除外)中不表达，是一个肿瘤特异性的抑制凋亡因子。本实验用免疫组织化学的方法检测了60例膀胱癌组织标本和10例正常膀胱组织标本中的Survivin蛋白的表达。结果显示在膀胱移行细胞癌组织中的Survivin蛋白阳性表达率明显高于正常膀胱组织(P0.01)；随着膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期的增高，Survivin的阳性表达率明显升高(P0.05或P0.01)；复发膀胱癌Survivin表达的阳性率明显高于原发膀胱癌(P0.01)。提示Survivin的表达与膀胱移行细胞癌的恶性程度、自然病程及判定预后等方面密切相关，这与陈冠峰等报道一致5。流式细胞术(flow cytometry，FCM)是20世纪80年代以来迅速发展起来的一种利用流式细

9、胞仪对生物细胞进行多参数快速分析和分选的高科技新技术，近年来已广泛应用于各种恶性肿瘤的研究，尤其是DNA含量的测定，包括DNA倍体和细胞周期分析等方面。据大量研究表明，恶性肿瘤细胞DNA含量大都呈不规则增高，表现为异倍体DNA类型6；且观察表明，膀胱肿瘤DNA含量与病变浸润深度有明显的相关性，随着肿瘤浸润深度的增加，异倍体出现率也增高。流式细胞学检查对原位癌的诊断准确率较高(可达90%)，对复发癌的诊断较膀胱镜早312个月7。本实验观察到在膀胱移行细胞癌组织中，DNA异倍体率明显高于正常膀胱组织(P0.01)；随着膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期的增高，DNA异倍体率明显升高(P0.05)；复发膀胱癌DNA异倍体率明显高于原发膀胱癌(P0.01)。这与国内王书奎等8报道DNA倍体含量相似。提示DNA的异倍体率与膀胱癌的发生、发展及预后密切相关。目前，国内尚未见到Survivin和DNA倍体在膀胱癌中相关性的报道，但在宫颈鳞癌的研究中发现，二者密切相关9。肿瘤细胞核DNA含量及倍体变化是反映瘤细胞生长繁殖能力的重要生物学指标，肿瘤的染色体倍性程度与增殖程度呈正相关。高的DNA含量数总是和高的细胞增殖率相关联的。本研究Survivin的表达和DNA倍体分析呈正相关提示细胞增殖力增强、细胞凋亡受抑是膀胱癌发生的机制之一。在膀胱移行细胞癌中凋亡与增殖也是紧密联系在一起的，并且互相促进。【参考文献】 1Sarafan-Vasseur N，Lamy A，Bourguignon J，et al. Overexpression of B-type cyclins alters chromosomal segre-gationJ

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