凝胶色谱柱操作
4页1、凝胶色谱柱操作1、溶胀商品凝胶是干燥的颗粒,通常以4063um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱 液中充分溶涨一至数天,如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸,则溶涨时间可 以缩短到12 小时。凝胶的溶涨一定要完全,否则会导致色谱柱的不均匀。热 溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。2、装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用,所以凝胶的填充要求很高,必须要使整个填充 柱非常均匀,否则必须重填。凝胶在装柱前,可用水浮选法去除凝胶中的单体、 粉末及杂质,并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有 机玻璃的凝胶空柱,在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定,加入少 量流动相以排除柱中底端的气泡,在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶 部连接一个漏斗,颈直径约为柱颈的一半,然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连 续地加入已经脱气的凝胶悬浮液,同时打开色谱柱的毛细管出口,维持适当的流 速,凝胶颗粒将逐层水平式上升,在柱中均匀地沉积,直到所需高度位置。最后 拆除漏斗,用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面,再用大量洗脱剂将凝胶床洗 涤一段时间。3、柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决
2、定于色谱柱装填得是否均匀,在对样品进行分离之 前,对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的,检查 方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯,用肉眼观察柱内是否有纹路或气泡 也可向色谱柱内加入有色大分子等,加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围, 如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整,即说明色谱柱性能良好;如果色带出现不 规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。4、上样 凝胶柱装好后,一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理,才能上样。凝胶柱 的上样也是一个非常重要的因素,总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为 了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱,一般在上柱前将样品过滤或离心。样品 溶液的浓度应该尽可能的大一些,但如果样品的溶解度与温度有关时,必须将样 品适当稀释,并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后,这时可打 开色谱柱的活塞,让流动相与凝胶床刚好平行,关闭出口。用滴管吸取样品溶液 沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中,打开流出口,使样品液渗入凝胶床内。当样品液 面恰与凝胶床表面平时,再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此, 每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床,又不
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