农杆菌介导转化法的概述

1、 年第学期级研究生生生物化学期末论文 任课教师： 开课学院: 课程名称: 学 院： 专 业: 学 号: 姓 名： 6月20日农杆菌介导转化法的概述摘要：自从983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因,通过多种措施转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。1 目前，应用于植物转基因较多的措施有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性，容易浮现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定体现的缺陷,而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统，外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术2。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在某些单子叶植物（特别是水稻)中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。核心词：农杆菌 转化措施转化效率有关农杆菌农杆菌3-5是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状

2、根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。1.1根癌农杆菌根据质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同,根癌农杆菌可分为种类型：章鱼碱型(Octopie)、胭脂碱型（Nopali）、农杆碱型（Aropine)和琥珀碱型(Scamon)。原始的i质粒根据其功能的不同可分为4个区：.1-NA区(ranferNAreion）：不同来源的菌株,T-DA的长度在124kb,它是在农杆菌侵染细胞时，从T质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA自身的转移与整合无关.T-D上最重要的是T-DA区两端的边界各为5bp的反复序列.其中14p是完全保守的,分10bp(CAAAT)和4bp(GTAA）不持续的2组.左右2个边界(LB和RB)是TDA转移所必需的,只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中,转移的方向是从右向左,DNA的右边界在TNA的整合中对于靶A位点的辨认具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。11.2毒性区(vi区)：位于T-DA以外的1个0kb的区域内,该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，

3、但对TNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为i质粒编码毒性基因（vir）。目前,对章鱼碱型农杆菌i质粒Ti1555和胭脂碱型农杆菌Ti质粒TiC8的vr区进行了全序列分析,在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子,分别为vi-vjrH，共涉及23个基因(rA，vir1-virB11，viC1，viC2，vir1vrD4,vir1,vir2,vrF,virG,vir)而胭脂碱型Ti质粒的vir区不含vjrF和vir操纵子,它具有另一种基因tzs,也有学者觉得有大概35个ir基因成簇排布于vi区。1.1.接合转移区(Cn区)：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra）,调控Ti质粒在农杆菌间转移。.1.4复制起始区(ori区):该区段调控i质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了T质粒上的基因参与外，尚有农杆菌染色体基因染色体基因包chv、hvB、att、pscA、D以及cv它们大多编码某些膜有关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和协助细菌附着于植物受伤细胞上。.2发根农杆菌 发根农杆菌(grobteriumrhizoenes)具有质粒,可以诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵

4、染植物是将其Ri质粒上的TDN插入到宿主植物基因组中,这一点与T质粒相类似。转移机制也类似,所不同的是vi区和T-DA区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上,irA的产物是一种跨膜蛋白，进一步激活iG的产物。T-DA区的T区具有较高的稳定性，区具有与生长素合成有关的基因tmsl和tms及农杆碱或甘露碱合成基因。TR区可进行改造,这样Ri通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核,进而使TDNA整合到植物基因组中。转化过程农杆菌介导的T-DA的转移和整合是细菌和植物细胞互相作用发生生物学效应的过程,兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其转化过程6-8如下:2.细菌在植物伤口处附着，使受伤的植物组织产生酚类化合物,诱导Ti质粒内ir基因的体现在植物受到创伤后,创伤组织的细胞释放出酚类化合物信号，如乙酰丁香酮(As)。当农杆菌接受到此类信号时,其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是构成植物细胞壁的某些特异单糖，As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir区基因的体现。ir区基因的活化一方面是从vrA基因开始的。ir

5、A蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应,其感应部位也许位于胞质区域。ir蛋白的胞质区域有自激酶的功能,自身被磷酸化激活后，使G蛋白活化。VirG蛋白是NA结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域,从而成为其他ir基因转录的激活因子，打开rB、iC、D、viE、vir等几种基因。vir、vir、vrE参与-DA复合体的形成和转移ChvE可结合某些单糖,也可直接与irA周质区互相作用，以加强s对Vir基因的诱导。2.2v基因体现的产物作用于T-DNA产生T-DNA链,进而转化形成-DN复合体，随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核内。VirD基因编码的两个产物VirD和VirD2直接参与加工过程.Vir1蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA变成松弛型NAVirD2蛋白具有特异剪切单链NA的内切酶活性,它可以辨认T-DA底链边界反复序列上的特定位点，并在底链24p反复序列和第四个碱基之间切割,将T-N从T质粒上剪切下来,称-链。切开T-DNA后,VrD2蛋白与T一链的5端共价结合,避免核酸外切酶降解T一链.新的T-A底链以此链为

6、模板,从右端产生的DN缺口处以5-方向进行合成。被取代的旧链游离出来,与许多VrE2蛋白分子结合构成T-DNA复合体。此外，ViD2作为一种导向蛋白，可以指引整个-DA复合体从农杆菌进入到植物细胞核。.3DNA整合进入植物基因组并体现产生生物学效应T-NA整合进宿主细胞基因组，是转化过程中最重要也最核心的环节。-DNA在寄主细胞染色体上的整合是随机的,但对转录活化区域有所偏好。T-NA通过与事先断裂的寄主N双链(SB)发生重组来完毕整合,进而进行体现。3转化措施 目前农杆菌介导转化单子叶植物最常用的措施是共培养法。运用农杆菌与植物离体组织共培养进行转化,一般需要通过严格的组织培养过程以再生植株,因而转化周期比较长。共培养前农杆菌感染愈伤组织的方式有：将整块愈伤组织浸泡于菌液中静置培养。将整块愈伤组织浸泡于菌液中摇动培养。将菌液加至愈伤组织上。一般使用的是第一种方式。现将农杆菌介导的植物遗传转化常采用的措施9，简要简介如下:3.1叶盘法 选用健康的无菌苗，用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养，农杆菌通过伤口使携带外源目的基因的Ti或i质粒进入植

7、物细胞，使外源目的基因整合到植物基因组中。它是双子叶植物较为常用也较为简朴有效的措施。3.2真空渗入法 该法转化的强健植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空解决，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株,在农杆菌的介导下，发生遗传转化。它是一种简便、迅速、可靠并且不需要通过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移措施,具有良好的研究与应用前景。3.3原生质体法 在原生质培养的初期，将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养,农杆菌的Ti或就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内,TDA就也许整合在受体基因组上。此外,作为载体法,新的转基因措施有：基于Ac/转座系统建立的转化载体；运用噬菌体PCre-ox位点的特异性重组系统;运用酵母线粒体I-Sel核酸内切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统；运用双链细菌人造染色体载体系统等,可以提高转化率或转基因位点质量。研究现状有关禾谷类单子叶植物农杆菌介导的遗传转化，初期的研究多采用其幼胚来评估不同条件下被农杆菌侵染的也许性。成果显示,TDA向禾本科植物中的转化没有明显障碍，但人们对整合过程的理解十分有限，

8、同步存在相称大的争议。在此基本上，人们运用大量实验去测试不同谷类植物的不同外植体对农杆菌侵染的反映能力,以期获得稳定的转化细胞或植株。Grmsley等（1987）一方面将玉米条纹病毒(maizesrekvis)的N通过根癌农杆菌转入玉米,转入植株体现出感染症状;ould等（19)用根癌农杆菌感染玉米芽尖，得到少量转基因植株;Shen等(1993)观测到农杆菌介导的gus基因转入玉米芽后-葡糖苷酸酶的体现；oon等（191）采用根癌农杆菌感染小麦胚得到转化细胞;Raner等（1990)和hn等(1992)通过根癌农杆菌感染未成熟胚得到少量水稻转基因植株。以上研究工作得到的转化频率很低,且没有足够的分子和遗传证据,这些研究成果很少为人们接受并承认,却是鼓舞人心的，为单子叶植物特别是禾谷类作物转基因研究的进一步开展奠定了基本。199年-9年获得了重大突破，h等(993)以水稻开花授粉后10-12天的幼胚为受体，经农杆菌感染后获得了转基因植株;iei等（199)以水稻成熟胚愈伤组织和未成熟幼胚为受体,获得了较多有严格分子生物学证据的转基因植株，并对农杆菌介导法转化水稻的影响因素进行了具体研究，建立了比较成熟的农杆菌转化水稻的技术体系，为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河。从此，农杆菌介导法的转化范畴扩展到了许多重要的单子叶植物，涉及香蕉、玉米、大麦、小麦、甘蔗、大蒜、洋葱、高梁和黑麦（Chngtal197;shdaeta99)101。存在问题与展望5.1植物受体因子与农杆菌间的作用机理 目前对农杆菌介导转化的机理及分子调控已研究比较进一步，但对有关植物因子的作用机理还知之甚少。许多研究表白，农杆菌介导单子叶植物遗传转化已具有了与双子叶植物相似的农杆菌自身的必要条件，但单子叶植物的转化相比较而言困难得多,这也许不仅是农杆菌一方的因素，单子叶植物的植物因子也也许起着核心作用，也不排除农杆菌和这些植物因子的互相作用。5.2转化率 大多数单子叶植物的转化受其基因型、外植体来源、组织培养难易限度等因素的影响，比较难，以至在重要禾谷类作物中的应用受到一定的限制，与双子叶植物相比，农杆菌转化单子叶植物还存在较大

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