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荧光定量PCR原理及实验步骤

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卖家[上传人]：汽***

文档编号：500878082

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1、荧光定量PCR原理及实验步骤、实时荧光定量pcr原理常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。几个概念：（1）扩增曲线：PWIIH 0-59占三黄比删斎扩增曲线图；sJLrW品和1ui -Idd蟻坐輛扩増循环数（鳥C氓八纵坐际荧光强度毎个搪环进行一次荧光信号的收；S（2）荧光阈值:荧光倍号阈值（thrmshold :前巧令衢坏信号作为荧光本辰信号（baselinej .即样本的蔬光背景值和阴性对聘的茨光值荧光谨烙的缺省设置杲*-込牛睛环的荧光信号的标谁偏差的10借手劫设置廊则荽大于样本的葵光背星值和阴性对照曲英光烯茴值.同时專屏呈选丼进入指数期的曇初阶坯并且保证回归棄敬大于0勺9真正的括号英光信号超过域值(3) Ct 值:Ct值的定义匕PCR扩增过程中、扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数-n- laQu(4)标准曲线模

2、板DNA3越多、荧光达到域直的循坏数越少.即Ct值越小 Log浓度与循环数杲线性关系通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲皴，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量SYBR Green 工作原理：1、SYBR Green能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green发荧光，在此阶段采集荧光信号。!i1Jpd 1 InKwMU(1十Tmd： DNA链一半时的温度将温度与荧光强度的变化求导。-dl/dT)f1融解曲塢分析加一厲I1无非特异性黄光Jl定重准韬i8*苴飽产呦出现非特异性荧模板DNA越釦荧光达到域值的循环数越少口 Log浓度与循环数呈线性关兼，根据样品U值就可以计算出样品中所含的模板量二实验步骤1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。1、将所需引物和SYBgreen （避光）拿出，解冻。计算好所有引物和SYBgreen 的用量。2、反应体系（25 UL）如下：H2O11 口 LSYBgreen12.5M1上游引物0.25 口 L下游引物0.25 口 LcDNA1 口 L可先将H2O和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。上机。

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