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PVP40法提取基因组DNA

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卖家[上传人]：汽***

文档编号：498704621

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1、主要试剂配制1) 1M Tris-HCl(pH7.4)称取60.55g Tris碱，加入400ml超纯水，搅拌溶解，用浓 HC1调pH值至8.0。2) 0.5 M EDTA(pH8.0)称取 93.05g NaQEDTAJO，加入 400ml 超纯水，搅拌溶解，用固体NaOH调pH值至8.0，定容至500ml,高温灭菌，室温保存。3) 5M KAc(pH5.8)称取147g KAc和57.5ml冰乙酸，加入400ml超纯水，搅拌溶解，用 KOH 调 pH 值至 5.8，定容至 500ml。4) 1xTE(pH8.0)取 Tris-HCl(1M, pH7.4)和 EDTA (0.5M, pH8.0)分别 5ml 和 1ml, 定容至 500ml。5) 50xTAE(pH8.5) 400ml 超纯水中加 121.1g Tris，18.6g Na2EDTA-2H2O，充分溶解后，加冰醋酸28.55ml，定容至500ml，室温保存。使用时稀释成1xTAE。6) 10xTBE Tris53.9g，H3BO3 27.5g，0.5M EDTA 20ml,超纯水定容至 500ml，备用。7)

2、DNA 提取缓冲液：称取 Tris 碱 6.05g，KCl 37.275g，0.5M EDTA 10ml，浓 HCl 调 PH 值至 9.5，定容至 500ml。8) DNA提取液：根据用量加入7.5g/L的PVP40、3.6g/L的亚硫酸氢钠。9) RNA酶：10mg/ml的RNA酶稀释至2mg/ml的RNA酶，以备TER溶液的配制。基因组DNA的提取和纯化本研究采用PVP-4 0法进行基因组DNA的提取。1) 打开水浴锅，调整温度至65C；2) 配制DNA提取液并置于水浴锅溶解，待用；3) 打开摇床，调整温度至60 C，待用；4) 取适量幼嫩冷冻叶片放入2.0 ml离心管中，并加入2个小钢球，于高通量组织研磨器上打磨2mi n，频率为3 0/s，叶片组织已磨好；5) 从65 C水浴锅中取出已溶解好的DNA提取液并趁热吸取600ul/each，迅速加入已磨好的样品离心管中，于高通量组织研磨器上充分混匀20s，频率为20/s；6) 摇床调频至450rpm，放入样品DNA，振荡保温1h；7) 取经高温灭菌过的1.5ml离心管，加入165ul/each异丙醇并于-20C冰箱冷却至少1h，待用；8）从摇床中拿出DNA样品并于小型台式离心机上3000rp m离心30s，停止即可；9）在通风厨中，每样品DNA管中加入200ulh PH值为5.8的KAC溶液，翻转几次，充分混匀，静置3 0min；10）静置后，将样品DNA放入小型台式离心机上13000rp m离心10min；11）轻轻取出离心好的DNA样品，吸300 ul上清液至已备好的冷异丙醇管中，轻轻混匀，室温放置 10min；12）11000rpm小型台式离心机上离心8min，得至到 DNA固体；13）倒掉上清液，加500ul 70%的乙醇清洗DNA，一般清洗2次为佳；14）室温干燥样品DNA；15）加200ul TER于已晾干的DNA样品管中，溶解固体DNA；16）摇床调频至15rpm，样品DNA于其上50C保温1h；待保温结束后，取出样品DNA于-20 C冰箱长期备用。

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