GM实验中文说明书

1、曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒中文说明书1. 用途：曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM试验）是用微孔板酶免夹心法，检测血清标本中 的曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）抗原。2. 应用指征：曲霉菌半乳甘露聚糖检测应与其他辅助检查如微生物培养，病理组织活检以 及影像学检查等联合应用，辅助诊断侵袭性曲霉病。3. 简要综述：曲霉菌感染通常发生于吸入环境中存在的曲霉菌孢子之后，在过去的十年中 这种侵入形式持续增加，并构成最严重的感染途径。曲霉菌感染主要发生在中性粒细胞 减少的病人（在抗肿瘤治疗后）和使用免疫抑制剂（器官移植，特别是骨髓移植）或皮 质类固醇的病人。曲霉菌很难从血培养中分离出。它的诊断一般基于非特异性的诊断或影像学依据（临床 症状， CT， X 线等）。目前，血清中的可溶性半乳甘露聚糖（GM）抗原检测是辅助诊断侵袭性曲霉病的血清 学方法。4. 检测原理：曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM试验）是一种单级微孔板夹心免疫酶检测可以检测人血 清中半乳甘露聚糖。该试剂盒采用针对曲霉半乳甘露聚糖的大鼠EBA - 2单克隆抗体， 并且在以往的研究中已经成为其特征。此单克隆抗体用来包被微孔板用以与结合抗原， 并检测致敏

2、微孔板上结合的抗原（结合试剂：过氧化物酶结合的单克隆抗体）。血清标 本在EDTA存在下加热处理为了分离免疫复合物并且使可能影响该实验的其他血清蛋白 沉淀。处理过的血清标本和酶标抗体加入到单克隆抗体包被的固相载体上，孵育。 GM 抗原由单克隆抗体-半乳甘露聚糖（GM）-酶标抗体组成。洗板，以清除未结合的物质。然后，加底物，底物与结合物反应呈蓝色。加酸后反应终 止，蓝色变为黄色。标本和质控物的吸光度（光密度）用波长在 450-620nm 的分光光 度计测量。5. 试剂说明：霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒产品号为 NO.62796（96 人份）试剂盒储存温度为2-8 C,使用前将试剂平衡到室温（18-25 C）。使用完后，除质控 物外，将所有试剂立刻放回2-8 C储存。试验后，阴性对照，临界Cut-off）值标准和 阳性对照必须-20 C保存。未用完的反应孔装回袋中重新封好，干燥剂勿仍。反应孔打 开后5周内用完。稀释后，清洗液在2-8 C可保存14天。其他试剂打开后都很稳定直 到过期。在最多9 个批次，试剂足够进行96人份测试。成分内容R1微反应孔， 反应板-96孔（12孔8条）包被有抗GM的单

3、克 隆抗体1个板/12*8孔R2-Tris NACL缓冲液1*100ml-1%吐温20-0.01%硫柳汞R3阴性对照血清-冻干的不含GM的人血清-HBsAg, anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV 阴性3*qs1ml （qs:量充足）R4Cut-off质控血清-冻干的含GM的人血清-HBsAg，anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV 阴性3*qs1mlR5阳性对照血清-冻干的含GM的人血清-HBsAg, anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HCV 阴性3*qs1mlR6酶结合物-抗GM单克隆抗体/过氧化物酶-防腐剂：0.01%硫柳汞1*8mlR7血清处理液EDTA酸性溶液1*10.5mlR8TMB （四甲基联苯胺） 底物缓冲液-柠檬酸和醋酸钠-0.009 %过氧化氢-4%二甲基亚砜1*60mlR9显色剂：TMB溶液（浓 缩）-含0.6%TMB的90%二甲基亚砜溶液1*1mlR10终止液1.5NH2SO41*12ml封微孔板的胶条1*8张6. 使用警告：1）用于体外诊断使用。2）仅为专业使用。3）不建议测试除人以

4、外血清。4） 阴性对照， Cut-off 对照，和阳性对照是由人血清制造，因此 HBsAg，anti-HIV-1， anti-HIV-2，anti-HCV 要符合 CE 认证标志的阴性标准。并且所有试剂按传染源处理。所有试验必须按照血源性病原体的OSHA标准，生物安全2级或其他适当的生物安全行 为。5）穿保护性衣物，包括实验衣，眼/面部保护，一次性手套（推荐合成的，非乳胶手套）， 并且严格遵守实验室操作规范处理试剂和病人标本。试验完毕后彻底洗手。6）不要用嘴移液。7）在处理标本和试剂盒的区域不要抽烟，饮水，吃东西。8）避免标本或试剂飞溅。9）不含酸的物质洒出来，应彻底用有效地消毒剂擦净。 注意：不要把含有漂白剂的液体放在高压灭菌器内。10）含酸的物质洒出来应该用适量碳酸氢钠稀释分解，并将此区域冲洗并擦干；如果有生物 危险物质，用化学消毒剂擦洗。11）所有试验用标本和其他物质都应当做传染媒介，实验室化学和生物废弃物必须按照国家 和地方规定处理和丢弃。12）注意：下面列出可能存在危险的化学试剂成分（指五部分试剂）：终止液 7.2的 H2SO4 是有腐蚀性的，可能灼伤眼睛和皮肤；如果吞食或接

5、触皮肤是有害的；可能导致很严重的眼睛损伤，包括视力永久的减弱甚至失明。远离强碱和还原剂。R34-41 会引起燃烧。伤害眼睛的风险很大。S24/25-26-30-36/39-60.避免接触皮肤和眼睛。一旦接触到眼睛，立即用大量清水冲洗 并求助医生。这些物质千万不能加水。穿适当的保护性衣物，带好手套，做好眼/面部保 护。这些物质和他们的容器一定要按照危险废物处理。这些物质的废弃物是危险酸性废物 ,就算国家或地方规章允许，也必须把它们中和到 pH6-9 变成无危险废物处理。0.01硫柳汞，对中枢神经系统有损害的有机汞防腐剂，有生物毒性并足够致敏；持续 或反复接触可导致某些敏感个体产生过敏反应；有足够的致敏事件致使稀释硫柳汞。避 免释放到环境中，累积效应很危险。含汞浓度超过0.2ppm必须按像美国联邦RCRA危 险废物处理（D009），但是，所有废物必须按照当地和国家规章处理。（注：硫柳汞 含汞 49.55%，所以 0.01 硫柳汞含汞0.005%（50ppm） w/v）。13）物质安全数据表是必要的。7. 注意事项：1 ）在未知条件下，冷藏保存的血清标本出现假阳性结果可能因为被真菌和（或）细

6、菌污染。2）不要用过期的试剂盒，或其中的任何试剂。3）除了浓缩洗涤液（R2）和终止液（R10）夕卜，不同批号试剂盒的试剂不能混用。4）将所有试剂至室温至少15分钟后使用。5）配比试剂时，彻底混匀，操作要小心避免微生物污染。6）不要在有易反应气体（酸、碱、醛）或灰尘存在的条件下做实验，这些物质可能会影响 酶的活性。7）用干净的一次性聚丙烯塑料容器盛放底物显色剂。如果必须用玻璃器皿，应首先用 1N 盐酸清洗，然后用蒸馏水冲洗，最后干燥处理。8）手工加质控物和标本时，必须换枪头防止交叉污染。9）保证充分洗板，按照说明书设定洗涤循环次数。并确保所有孔全部注满然后全部吸净。 不要用挤瓶手工洗涤。10）在洗涤循环结束，然后加试剂之前，避免微孔板干燥。11）酶结合物和底物不能用同一容器盛放。12）酶结合物和底物显色剂不要接触金属或金属离子。13）显色剂避光： TMB 或其他底物显色剂在储存或孵育时要避免见强光。显色液要避免接 触氧化剂。14）终止液要避免接触氧化剂，金属和金属离子。15）用干净无尘的器具（试管，枪头，容器等）以减小环境中污染曲霉菌孢子的机率。因 为 GM 是热稳定性的，材料消毒不能确

7、保消灭抗原。无热源物质是最好的选择，但是用标 准材料要有充分准备。16）限制液体（血清，血清稀释液，酶结合物）或开放容器（微孔板，试管，加样枪）暴 露在空气中。17）未用完的酶结合物不能倒回原容器。18）底物显色剂必须是无色的。稀释后一旦出现蓝色说明试剂被污染了，弃去重新准备试剂。8. 试剂准备和储存微孔板（R1）打开的微孔条2-8C可稳定5周，用后要封好原袋。洗涤工作液（R2）制备洗涤工作液，浓缩洗涤液和去离子水（蒸馏水）比例1： 9。2-8C洗涤工作液能保存 14天。为一次实验制备充足洗涤工作液（80ml 一条：8mlR2+72ml蒸馏水）。浓缩洗涤液打开后于2-25C保存，在无污染情况下，会一直稳定直到过期。阴性对照（ R3）实验之前，将lml去离子纯净水（最好是无热源水）加到装有阴性对照质控品的瓶子内，需 要2-3分钟充分混匀，然后分装在3个聚丙烯离心管内，每个300口1，溶解后暂时不用的阴 性对照应立即放-20C保存，使用之前要解冻。注意：先溶解再冷冻于-20C的质控血清，解冻使用时不用再加水溶解。冷冻的质控品可保 存5周。质控血清和患者标本以相同方式处理（300口1血清+1

8、00口1血清稀释液，等等）。Cut-off质控血清（R4）和阳性对照（R5）同阴性对照血清底物显色剂（ R8+R9）制备底物显色剂：浓缩显色剂（TMB溶液，R9）与TMB底物缓冲液（R8）比例为1:50。每条 反应孔需要2ml底物显色剂：40|j|R9+2mlR8。室温（18-25C）避光可稳定6小时。R8和R9开启后储存于2-8C，如没有污染，可稳定直到过期。酶结合物（R6），血清稀释液（R7）和终止液（R10）R6, R7, R10开启后储存于2-8C，如没有污染，可稳定直到过期。9. 标本采集 按实验室规范采集血液标本。该实验需用血清，血清标本不能被真菌或细菌污染。要用密封 试管，不能暴露于空气中。实验前未打开标本在2-8C可保存5天。打开后标本需在48小 时内完成检测。如需长时间储存，存储温度应为-70C。 血清标本最多可冻融四次。解冻标本检测之前要充分混匀。20mg/L胆红素，或相当于2g/L甘油三酯的脂血，或165mg/L血红蛋白的溶血标本不影响检 测结果。有关白蛋白增多的干扰尚未进行测试。10. 步骤 提供的试剂 看试剂说明表格需要但未提供的物质1）去离子水或蒸馏水，用来

9、稀释浓缩洗涤液。2）去离子纯净水，用来制备质控血清。3）吸水纸。4）一次性手套。5）防护眼镜。6）次氯酸钠（漂白剂）和碳酸氢钠。7）可调或固定移液器,可测量和移取50口1,100口1,300口1和10001的量。8）1.5ml聚丙烯密封离心管，能耐热120 C （加热块）或100 C （沸水浴）。a. 螺旋口离心管：美国Bio-Ra伯乐224-0100，1.5ml锥形管或其他同作用商品。b. 普通微量离心管：美国Bio-Rad伯乐223-9480 EZ Micro Test Tubes或其他同作用商品。9）微管盖锁（VWR Cat.#6054001或他同作用商品）。温度或压力改变时，微管盖锁能安全地阻止密封管帽打开；也能使微量管轻易地从加热块或沸水浴中提起来。10）1.5ml聚丙烯微量管在实验室台式离心机离心力lOOOOg。11）浮动的微离心架。12）螺旋搅拌机。13 ）加热块。推荐以下两种规格：a. 一块式：Grant Cat.#QBDl（VWR Cat.#460-0074）b两块式：Grant Cat.#QBD2（VWR Cat.#460-0076）14）加热块中的热块：热块必须用 Grant block Cat.#QB-E1（VWR Cat.#460-8517）15）100C的沸水浴箱。16）37C1C微孔板培养箱。17）半自动或自动洗板机。18）装有450nm和620nm滤光器的酶标仪。试验评估每次试验阴性对照，阳性对照和 cut-

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