细胞培养传代冻存复苏操作规程(自编)
12页1、细胞培养程序材料A、仪器1. 净化工作台,2.离心机,3恒温水浴箱,4.冰箱(4C)5. 倒置相差显微镜, 6. CO2 培养箱, 7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪, 9. 移液枪, 10. 电磁力搅拌机, 11. 微孔滤器B、玻璃器皿1. 吸管,2.小烧杯(100ml), 3.废液缸,C、塑料器皿1. 吸头, 2. 枪头, 3. 96 孔培养板, 4. 15ml 离心管,5. 50ml 离心管, 6. 胶塞,D、其他物品1. 微量加样枪, 2. 红血球计数板,F、试剂1. D-Hanks 液, 2. 小牛血清, 3. RPMI1640,4. 双抗(青霉素、链霉素), 5. 0.25%胰酶, 6.0.025% EDTA7. 二甲基亚砜( DMSO),8. MTT溶液:称取250mgMTT,放入小烧杯中,加50ml培养液或平衡盐溶液在电 磁力搅拌机上搅拌30min,用0.22um的微孔滤器除菌,分装,4C保存备用,两 周内有效。一、原代细胞培养或细胞株(系)复苏培养:(一)细胞原代培养1. 贴壁细胞培养法:1)、组织块培养法将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/
2、ml的生理盐水漂洗2此, 5 分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴,置青霉素小瓶中,加两滴小牛血清, 用剪刀尽可能将其剪碎,用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁,倒置于37、 5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置,从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液(小 牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml),使组织块有培养液与其接触 为准,轻轻放置于 37培养。待24 小时候补液。或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶 塞,将瓶倾斜放置在37C温箱内。培养24小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢 翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块 漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠 尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养 24 小时后 再补液,培养 35 天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小 块所产生的毒性作用。其他方法:消化分离法 、器官培养 略2. 悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌 细胞和免疫细胞无需消化
3、,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层 液分离后接种培养。(二) 细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤(1) 佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。(2) 迅速放入38C水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化。(3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用 75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管 将细胞悬液注入离心管中,再滴加 10ml 培养液。(4) 在1000r/min速度下离心510分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种 于培养瓶中,接种浓度1X109/L,置37C温箱静置培养,次日更换一次培养液, 继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞 加入瓶中,并加入培养基贴壁培养1224小时后,充去上清,换入新鲜培养基 继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量,如果冻存数量为 106,则稀释 10 倍使细胞达到 105即可。注意事项 在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管, 使之尽快通过最易受损的温度段(-50C)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生 长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有
4、时也会有部分细 胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以 适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。二、细胞维持培养(细胞换液培养)、培养选拔常规观察( 一 ) 原代细胞的维持1、贴壁细胞(包括半贴壁细胞的换液) 一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次,其换液方法比较 简单,即弃去旧液,加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较 长时间内能维持存活,但不需增殖,此时要换成含 2%小牛血清的维持液。 待不 同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。2、悬浮细胞 凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞,需在倒置显微镜下方可 观察到细胞的形态和生长现象,淋巴细胞的短期培养无需换液,但加入生长因子 或有丝分裂源(PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等)后,细胞不仅会发生转化而且 会发生分裂繁殖,此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求,加之代 谢产物增多, pH 变酸,细胞不适宜生长,需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细 胞体外长期培养时,都需换液培养,待达到饱和密度时才能传代。换液时,只能 采用半量换液的方式,千万不能采取倒
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