ELISA实验操作中常见现象理论探讨

1、ELISA 实验操作中常见关键词理论探讨（一）关键词 1：乳化与去乳化在 ELISA 实验操作中，经常会遇到样本乳化，导致检测结果较差的现象。乳化属于胶体化学范畴，是指一种液体以细小液滴（分散相）的形式分散在另一不 相溶的液体（连续相）中，这种现象称为乳化现象，生成的这种液体称为乳状液或乳浊 液。乳化液可分为“水包油”和“油包水”两种类型。在液液萃取过程中，往往会在两相界面产生乳化现象，这种现象对于萃取过程的 进行通常是不利的，给分离带来麻烦，即使采用离心机，也很难将两相完全分离，例如 实验操作中形成的是油包水形式的乳状液，而我们需要的目标物为油相，则造成油相体 积减少，以致油相不够取的现象，给实验带来不便；如果实验中形成的是水包油形式的 乳状液，而我们需要的目标物为油相，则会造成油相的药物浓度升高，造成回收率上升， 出现假阳性的现象。因此必须设法破除。乳化和去乳化的本质是表面现象，从热力学关系推演可知乳化的产生是一种自发过 程，而乳状液本身又是一个不稳定的热力学系统。乳化液可分为“水包油（O/W）”和“油 包水（ W/O） ” 两种类型，出现何种类型的乳化液，主要由表面活性剂的性质决

2、定，如 果表面活性剂的亲水基团强度大于亲油基团，则易形成O/W型乳状液；如亲油基强度 大于亲水基，则易形成W/O型乳浊液。一般常用HLB数（亲憎平衡值）来表示，一般 来说，HLB数愈大，亲水性愈强，形成O/W型乳状液；HLB愈小，洒油性愈强，形成 W/O 型乳状液。乳状液的消除方法甚多，有过滤分离、化学法（加电解质破坏双电层）、物理法（加 热、稀释、吸附等）、顶转法（加入其他表面活性剂）等，一般实验中采用物理法进行 操作，可减少实验误差.比如稀释法（硝基呋喃类药物代谢物实验操作中如果乙酸乙酯 不够取的情况下加入一定量的乙酸乙酯）或者加热法（在正已烷与复溶液形成的乳状液， 先去除正已烷层后 60 度水浴除去乳化层）。关键词 2：振荡提取ELISA 实验操作中最常见的提取手段就是振荡提取，提取的本质是利用的萃取进 行液-液分配或液-固分配的过程。萃取过程一般分三个过程：混合，萃取剂与原物密 切接触；分离，萃取相与萃余相分离；目标相回收，把萃取相从混合溶剂中分离。一般萃取步骤利用间歇操作，也可以进行连续操作。在ELISA实验中，间歇操作 的回收率优于连续操作。另外，间歇操作也在一定程度上可以

3、防止有机溶剂过分膨胀而 导致的喷出现象。一般说来，由于错流萃取过程能使萃取剂与萃余相充分接触，平衡常数能在最短的 时间内达到平衡，所以错流萃取的效果优于其他简单萃取过程。而且错流萃取能很好的 便平衡常数保持在一个程度，对操作的平行性有所帮助。所以在ELISA实验操作中都 是利用振荡提取进行操作的。综上，在做 ELISA 实验操作中利用间歇性的上下往复振荡操作进行提取就可以达 到多级错流萃取的目的。关键词 3：离心分离在ELISA的前处理操作中，常会遇到固-液或液-液需要分层的情况，在实际操作中 一般利用静臵分层或离心分离进行两相分层。离心分离相对于静臵分离来说有速度快、 分离效果好、杂质干扰少等诸多优势。故在 ELISA 实验操作中都是利用离心分离进行 操作，主要设备是离心机。离心分离对那些固体颗粒很小或液体黏度很大，过滤速度很慢，甚至难以过滤的悬 浮液十分有效，对那些忌用助滤剂或助滤剂无效的悬浮液的分离，也能得到满意的结果。 离心分离不但可用于悬浮中液体与固体的直接分层，也可用于两种互不想溶的液体的分 离，如前处理常用到的液-液萃取，以及不同密度固体或乳浊液的分离。离心分离可分 为三

4、种形式：离心沉降，利用固液两相的相对密度差，在离心机中进行分离操作； 离心过滤，利用离心力并通过介质，在离心机中进行分离操作；离心分离与超离心, 利用不同溶质颗粒在液体中各部分分布的差异，分离不同相对密度液体的操作。一般在 ELISA前处理操作中用到的是离心沉降与离心分离两种。离心沉降的基础是固体的沉降，离心分离的基础是两种溶剂在任何时候均不互溶， 且有一定的密度差。当粒子在无限连续流体是沉降或分离时，受到两种力的作用，一种 是连续流体对它的浮力，另一种是流体对运动粒子的粘滞力。如果这两种力达到平衡， 粒子将保持匀速运动，分离将会受限制。离心的效果主要是由离心分离因数Fr（又称 离心力强度或离心力）来定量评价：F r = （j2i/g =11.19* （rpm/1000） 2 * r *gFr表示了粒子在离心机中产生的离心加速度与自由下降的加速度之比；Fr越大， 越有利用分离。一般实验操作要求的3000g都是表示为离心力。对于不同的离心机来说 有不同的转数可以达到该离心力，如以实验室常用的安亭的50A或50D型号的离心机 来说，该离心机的离心半径约在13cm到15cm之间，根据样本体积

5、多少有所差异。那 么换算下来，转速要达到4300rpm到4600rpm才能提供3000g的离心力。如果转速低 于该速度，而离心力与浮力已达到一个平衡的话，那么常规的延长离心时间达到的效果 也是并不明显的。关键词 4：萃取在 ELISA 实验前处理操作中，大多实验都是采用在样本中直接加入试剂进行提取 或提取后再加入某他试剂进行再次提取来进行操作的，按照化学分离工艺上来讲，这其 中几个操作都是利用萃取的方法进行样本提取的。萃取有以下几个优点： 传质速度快、 操作时间短，分离效率高、操作简单，应用相当普遍，能量消耗较少，设备投资费 用不高，采用多级萃取可使阳性降低，便于检测。按照萃取对象的不同，萃取可分为以下几种形式：液-固萃取，液-液萃取和液-气萃 取。在 ELISA 实验操作中基本都是利用的液-固萃取和液-液萃取二种形式。液-固萃取 主要是利用溶剂与固体样本充分接触后把药物从样本中溶解到相应的提取液中再进行 下一步操作。液-液萃取主要利用的是与水不相溶的有机溶剂与试液（一般为水相）一 起振荡，由于各种不同物质，在不同的溶剂中分配系数的大小不等，这时一些组分进入 有机相中，另一些组分仍留在

6、水相中，从而达到分离和富集的目的。液-液萃取是物质在互不相溶两种液相之间分配的过程，物质在两相中的分布服从 分配定律，即：在一定温度和压力下，物质 A 在有机相与水相中分配达到平衡时，其 浓度比为一常数，通常称为分配系数Kd，一般情况下，溶质浓度增加，分配系数随之 降低；温度升高，分配系数亦随之降低。但溶质浓度较低时，分配系数kA被视为常数。 若溶质是电离物质，溶液PH值的变化也会引起分配系数的改变。CKa（有机）dCA （ 水）当溶质 A 在水相或有机相中发生电离、聚合等作用时，就会存在着多种化学形式 由于不同形式在两相中的分配行为不同，故总的浓度比就不是常数.溶质A在两相中的 总浓度比值，则称为分配比,用符号 D 表示。cDa总（有机）cA总（水）心、分配系数和分配比概念不同，关注的对象有差别，但是两者也有一定的联系。分配 比随着萃取条件变化而改变。因而改变萃取条件，可使分配比按照所需的方向改变，从 而使萃取分离更加完全。 而分配系数则为一常量。在 ELISA 实验中遇到的药物大多为有机药物，也可看作为有机物的的萃取，通常 情况下，有机物的溶解规律是极性有机化合物，包括易形成氢键的

7、化合物或盐类，通常 溶于水而不溶于非极性或弱极性有机溶剂；非极性或弱极性有机化合物则不溶于水，但 可溶于非极性和弱极性有机溶剂。所以在做ELISA前处理操作研发的时候都遵循相似 相溶的原理进行萃取剂选择。由于药物性质的不同，会导致同一萃取剂对每种药物的萃 取效率也不尽相同，也就形成了多残留检测试剂盒的多种药物回收率会有所差异；这也 是每种试剂盒前处理方法会有所差异的主要原因之一。一般说来，萃取操作的步骤越多，每一个步骤的萃取效率都不可能在100%，那么 每一步的操作都会对样本带来损失，那么假阳性率越低，同时回收率也越低。 关键词 5：读板在试剂盒操作的最后一个步骤即是利用酶标仪对实验结果进行数字化，也就是常说 的“读板检测0D值”，检测单位用0D值表示，0D是optical density （光密度）的缩 写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD = log （ 1 / trans ）,其中trans为检测物的透光 值。根据Bouger-amberT-beer法则，0D值与光强度成下述关系：E = OD = logl0/l其中E表示被吸收的光密度，10为在检测物之前的光强度，I为从被检测物

8、出来 的光强度。OD 值由下述公式计算：E = OD=CxDxEC 为检测物的浓度D 为检测物的厚度E 为摩尔因子做 ELISA 实验都是利用的专门仪器（酶标仪）进行测量的，酶标仪的前身是常见 的分光光度计，它主要是利用浓度有差异的物质对同一种光的吸收率不一样，而分辨后 进行数字化显示的装臵。分辨酶标仪的优劣最主要的参数是最大检测值和仪器变异度。光是电磁波，波长100nm400nm称为紫外光，400nm780nm之间的光可被人 眼观察到，大子 780nm 称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是因为光照射到物体 上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标 仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。光波波长与可见颜色关系如下图所示：TOOnmd,nririm435nm480nm490nm光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一 种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。最大检测值是衡量酶标仪好坏的重要指标之一，仪器中的检测器接收透过被检测物 的光能量，转换成二进位数字信号，最大为 4095。仪器定义没有光线通过的透光值

9、为 0，没有检测物的透光值为100。则实际检测中，检测物的透光值均在 0一100 之间。透光值的计算如下：OD=log(1/T)T =( Meas-Min )/( Max-Min )其中T为透光值，Meas为检测的二进位数值，Min为在0%的情况下检测的二进 位数值，Max为在100%的情况下检测的二进位数值。其中这些参数均可以在酶标仪的 说明书进行查找。一般常见的酶标仪的最大检测值在3.000-3.500不等，均可满足ELISA 操作的需要。关键词 6：双波长检测在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最 多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测 物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。一般来说在ELISA操作中出现 的黄颜色溶液，在 450nm 波长下会有最大的吸收值。但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸 收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收 最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。在ELISA酶标仪中 一般采用最大波长作为参照波长，以消除非特异性吸收以及底部的指纹等其他干扰。所以在做现代 ELISA 实验时，最好能选择双波长进行读数，可最大限度的消除指 纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确性。关键词 7：衍生化在硝基呋喃类药物的代谢物的前处理过程中，代谢物在组织中是与蛋白呈结合状 态，采用普通的有机溶剂或缓冲液，是无法提取该代谢物的。需要用盐酸水解后才能使 呋喃类代谢物游离，所以在加入去离子水、盐酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混合均匀后， 其pH应在1-3之间，否则不利用水解代谢物。在衍生化过程中，温度和时间决定其衍生化产率，衍生化后在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时，其pH应在中性左右。由于部份 样本的缓冲能力不同，所以需对其 pH 进行测定，因为在酸性或碱性环境中，不利于呋 喃类代

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