层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识

1、层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识一、实验目的和内容目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2. 熟悉凝胶层析的一般过程；3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容：1. Sephadex G-50 凝胶柱的装填；2. 凝胶柱柱效测定； 3凝胶再生的方法。二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱（1x40 cm ）,砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴 头吸管2. 实验材料和试剂Sephadex G-50, 0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5%丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤 清洗层析柱 测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积 根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量 称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS 在100 r水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出 关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始） 边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，

2、使其自然沉降 等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积 待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口 通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定（流速0.51 mL/min） 始终保护凝胶上端有一段液体 准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切 沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免 将床面凝胶冲起 （参考完成时间 11：30） 打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹 紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次 加入34 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽 将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液 口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.51 mL/min流速洗脱， 记录tr（记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏

3、度为 0.1A）， 计算单位高度的柱效 （参考完成时间 16：00）柱效计算公式：N = 5.54q/（ W1/2） 2其中，er为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。Sephadex G-100每米理论塔板数为30006000四、注意事项1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免 因此压紧凝胶。3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝 胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。4. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。五、演示（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法1. 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插 头。2. 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。 记录仪量程调在10mV档上。3. 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100%T档。4. 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录

4、仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机 稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。5. 把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂 家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100%T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV 数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测 仪数字显示为“0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在0位 。6. 上述 5 个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就 能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。7. 测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。记录仪光吸收A读数当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。 如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录 纸一半（50%刻度）位置时即为0.25A。数字显示光吸收A读数（可变量程读数模式）当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时

5、数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如 显示为080即表示为0.80A。当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为：A量程选定在0-2.0档时，数显读数x2=实际光吸收读数AA量程选定在0-1.0档肘，数显读数x1=实际光吸收读数A（二）部分收集器的操作方法：1.将“手/自”框内的键置于自动状态，按 “定”和“停”;使定时时间为零，放开 “停”按“快”或慢（“定仍按着）至所需的定时时间，放开慢和定”，再按一下停设定定时时间工作就完 毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走 时时刻，则需按下秒”键。2定位，将顺/逆”键置于顺”或“逆”状态，按手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工 作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆键置于“逆或“顺状态，本仪器就会自动地对准第一个 试管（在“顺状态，第一臂试臂为最外的那根。在逆状态，第一臂试管为最内的那根）。如 滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。七、背景资料凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据 被分离物质的分子大小不

6、同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完 全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁 移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小 的生物分子保留值大，后从柱中流出。凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等 生物大分子，也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶 层析的使用进行具体介绍。(1)卫oOO 0o oDOO(2)(3)(5)大分子STIrlcoQlyoz-图1凝胶层析的原理（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验， 组别分离时，大多采用20 -30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层 析柱，其直径在1 -5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 （一般制备用凝 胶柱，直径大于2cm，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上）。分离度取决于柱 高，为分离不同组分，凝

7、胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软 凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m。 分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 2030cm，柱高与直径的比较5:1-10:1 ,样品溶液体积应小于凝胶床体积为的20%。分 级分离时柱高与直径之线为20:1-100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑 滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现 拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000 ），样品溶液 体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质， 可以用凝胶层析法除去， 这一操作称为脱盐。 适用的凝胶为 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体 积可达柱床体积的 20 25 % ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上， 一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收 集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。（二

8、）凝胶的类型常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下：种类及主要用化学组成部分型颗粒大小分离性能g溶胀时间/h途号（/目数）2025 C90100 CG-10100-20070031G-15120-200150031由葡聚糖和G-2550-400100-5,00031葡聚糖凝胶甘油基通过G-5050-400500-30,00031（Sephadex G-）醚桥交联而G-75120-4001,000-8,000243成G-100120-4001,000-15,000723G-150120-4001,000-30000725G-200120-4001,000-60,000725P-250-400200-1,80042P-450-400800-4,00042P-650-4001,000-6,00042P-1050-4001,500-20,00042由 丙 烯 酰 胺聚丙烯酰胺凝和双丙烯酰P-30 和双丙烯酰50-2002,500-40,000123胶（Bogel p-）胺共聚而成P-6050-2003,000-60,000123胺共聚而成 P-10050

9、-2005,000-100,000245P-15050-20015,000-150,000245P-20050-20050,000-20,000485P-30050-20060,000-400,000485由D半乳糖A 0.5m50-40010,000-500,000由D-半乳糖A 1.5m50-40010,000-1,500,000琼脂糖 凝 胶和3、6脱水A 5m50-40010,000-5,000,000（Sepharose的L-半乳糖A 15m50-40010,000-15,000,000gio-gel ）连接而成，为A 50m中性琼脂糖50-400100,000-50,000,000ip 1 土卯刀日型白A 150m50-2001,000,000-150,000,000（三）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量 的2倍，例如Sephadex G-200的吸水量为20 ,1克Sephadex G-200吸水后形成的凝胶体积约 40mL 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流 速慢。一般实验室分离蛋白质采用 100-200

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