原核表达(原理、材料与实验方案)

1、原核表达(原理、材料与实验方案)一、原理1、E.coli表达系统E.co/是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE以检测表达蛋白质。2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-0-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。二、材料1、诱导表达材料(1)LB(LuriaBertani)培养基酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围：大肠杆菌(2)IPTG贮备液：2gIPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22pm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，一20C保存。(3)lx凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SD

2、S(电泳级)0.1溴酚蓝10甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 )酶溶法(1)裂解缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI(2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。(3)10mg/mL溶菌酶。(4)脱氧胆酸。(5)1mg/mLDNaseI。2 )超声破碎法(1)TE缓冲液。(2)2xSDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2溴酚蓝20甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2)按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。(3)筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序列测定，确定无误后进行下一步。(4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32C培养数小时，使培养液的OD6oo达0.406,迅速使温度升至42C继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37C培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmo

3、l/L。继续培养3-5h。(5)取上述培养液1mL,1000g离心，1min，沉淀，加100pL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS-PAGE检测。2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1)细菌的裂解常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法、已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；0-1,3-葡聚糖酶；0-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为： 4C，5000rpm离心，15min，收集诱导表达的细菌培养液（100mL）。弃上清，约每克湿菌加3mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。 每克菌加8pLPMSF及80pL溶菌酶，搅拌20min；边搅拌边每克菌加4mg脱氧胆酸（在冷室中进行）。 37C，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20pLDNaseI。室温放置至溶液不再粘稠。（2）超声破碎法。声频为15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操

4、作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA进行剪切，大大降低液体的粘稠度。 收集1L诱导表达的工程菌，40C，5000rpm离心，15min；弃上清，约每克湿菌加3mLTE缓冲液。 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10000g离心，15min，分别收集上清液和沉淀。 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2x凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE。注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3-4次冻溶后更容易破碎。2 ）包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100/EDTA或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。（1）试剂与配制 洗涤液I：0.5%TritonX-10010mmol/LEDTA（pH8.0）溶于细胞裂解液中。 2x凝胶电泳加样缓冲液。（2）细胞裂解混合物12000g离心，15min,4C；弃上清，沉淀用9x洗涤液I悬浮；室温放置5min;12000g离心15min,4C；

5、吸出上清，用100pL水重新悬浮沉淀；分别取10pL上清和重新悬浮的沉淀，加10pL2凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE。3 ）包涵体的溶解和复性（1）试剂与配制 缓冲液I：1mmoI/LPMSF8moI/L尿素10mmoI/LDTT溶于前述裂解缓冲液中。 缓冲液口：50mmoI/LKH2PO41mmoI/LEDTA（pH8.0）50mmol/LNaCI2mmol/L还原型谷胱甘肽1mmol/L氧化型谷胱甘肽KOH和HCI。 2x凝胶电泳加样缓冲液。(2) 用100pL缓冲液I溶解包涵体；室温放置lh；加9x缓冲液室温放置30min,用KOH调pH到10.7；用HCI调至pH8.0，在室温放置至少30min;1000g离心，15min，室温；吸出上清液并保留，用100pL2x凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取10pL上清，加10pL2凝胶电泳加样缓冲液，与20pL重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE。四、注意事项(1)不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。(2)表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导细胞。(3) 由于大

6、肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：(1)选择标志的编码序列；(2)可控转录的启动子；(3)转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；(4)一个多限制酶切位点接头；(5)宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中(测序验证)转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。2、100mMIPTG(异丙基

7、硫代-0-D-半乳糖苷)：2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22pm滤膜抽滤，-20C保存。二、操作步骤(一)获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5a，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB（含Amp50pg/ml）中37C过夜培养。2、按1:50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中，37C震荡培养至OD6oo竺0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37C震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml,离心12000gx30s收获沉淀，用100pl1%SDS重悬，混匀，70C10min。5、离心12000gx1min，取上清作为样品，可做SDS-PAGE等分析。三、注意事项|1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

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