马铃薯中龙葵碱的测定

1、马铃薯中龙葵碱的测定一、龙葵碱的简介及性质：龙葵碱又名茄碱、龙葵毒素、马铃薯毒素，是由葡萄糖残基和茄啶组成的一种弱碱性糖苷。不溶于水、乙醚、氯仿，能溶于乙醇，与稀酸共热生成茄啶(CHNO)及一些糖类。茄啶能溶于苯和氯仿。存在及毒性：龙葵碱广泛存在于马铃薯、番茄及茄子等茄科植物中。在番茄青 绿色未成熟时，里面含有龙葵碱。马铃薯中龙葵碱的含量随品种和季节的不同而有 所不同，一般为0.005%0.01%，在贮藏过程中含量逐渐增加，马铃薯发芽后，其 幼芽和芽眼部分的龙葵碱含量高达0.3%0.5%。龙葵碱口服毒性较低，对动物经口 的LD50为：绵羊500mg/kg体重，小鼠1000mg/kg体重，兔子450mg/kg体重。人 食入0.20.4g龙葵碱即可引起中毒。龙葵碱并不是影响发芽马铃薯安全性的唯一 因素，引起中毒可能是与其他成分共同作用的结果，其毒理学作用机理还需要进一 步研究。二、龙葵碱的提取方法1. 单溶剂法单溶剂法就是用一种溶剂来提取龙葵碱，采用的溶剂有甲醇或1%乙酸。Jellma等1981)详细地描述了甲醇法。该试验用甲醇萃取，把甲醇挥发掉后用乙酸溶解，然 后调PH9，水浴，静置，沉

2、淀:沉淀用冷氨水冲洗，加甲醇溶解，离心，取上清液， 旋转蒸发至干(防止烧焦)，即可得样品。单溶剂使用的甲醇有毒，且甲醇没有挥发 完全，使龙葵碱的提取不完全，回收率较低。用乙酸提取时，淀粉难于除掉，要利 用乙醇去除淀粉，使实验过程过多，误笙增人。2. 双溶剂法双溶剂法就是用两种溶剂来提取龙葵碱，采用的溶剂有甲醇和氯仿、96%的乙酸与1%乙酸以及1 一庚烷磺酸和乙酸。Fitzpatrick等(1974)详细地报道了甲醇和氯仿的 方法。样品中加提取液抽滤，滤液加 Na2SO4，放置于分液漏斗中分层。取甲醇层， 旋转蒸发甲醇，浓缩液加H2SO4;水浴回流，用碱调节pH，苯萃取，旋转蒸发苯至 干，即可得样品。该方法使用Na2SO4分层效果欠佳，弃去的氯仿层中仍含有一定 数量的甲醇，而甲醇中含有龙葵素，使结果偏低；另外，该法使用硫酸高温回流时， 使龙葵素水解，限制了其准确的定量检测法。Haddadin等(2001)与宁正详等(1998)采用的混合溶剂是乙酸与乙酸。该方法利 用酸性环境下，乙醇溶解龙葵碱，然后挥发掉乙醇，用碱处理，得到龙葵素粗样品。 该方法操作过程中，由于有脂肪提出，使酸溶解龙葵碱不

3、完全，造成结果偏小。3. 混合溶剂法混合溶剂法就是利用三种以上溶剂来提取龙葵碱，采用的溶剂系统有水一冰乙酸一 亚硫酸钠或四氢吠喃一水一乙睛一冰乙酸等。Bushway等(1985)采用的是四氢吠喃 一水一乙睛一冰乙酸方法。样品加混合提取液，G1漏斗抽滤，将滤液旋转蒸发至 5ml左右。浓缩液加2ml冰乙酸，然后用提取液将其转移至离心管中，超声波处理 后，离心。取上清液，加浓氨水，水浴，静置，离心，沉淀即是粗样品。混合溶剂 的方法回收率较高，但溶剂较贵，并且需使用昂贵的仪器，使成本过高。三、龙葵碱的测定方法马铃薯中龙葵碱的测定方法已经有很多报道，采用的方法主要有比色法，高效液相 色谱法，酶联免疫法，薄层层析，气相色谱法和显色滴定法。1.比色法比色法的仪器是分光光度计，利用龙葵碱酸解后，在浓硫酸环境下与甲醛显色反应 的性质，通过测定吸光度确定含量。Haddadin等(2001)将样品用乙醇和硫酸溶解， 然后加硫酸静置，添加0.5%甲醛。静置3小时后比色。宁正详等(1998)是将样品用 硫酸溶解，取出2ml，于冰浴中添加5ml浓硫酸，其时间不能少于3分钟，静置1 分钟后，添加的1%甲醛溶液，静置

4、90分钟后，于分光光度计520nm处比色，测出 其吸光度，对照标准曲线，求出其含量。比色法的优点就是所需的仪器很简单，具 有很好的操作性，同时所需的时间也不是很长，其缺点就是精确度没有其余的方法 高。2高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法：根据龙葵碱在流动相中的吸附性不同，所通过的速度不同，峰的出现时间也不同。国外目前的研究大部分都是采用此方法，如Bushway等(1986)、Carman等(1986)。Friedman等(1992)采用高效液相色谱法确定龙葵碱的含量。实验 中采用的是Beekman334液相色谱(其柱子为C.，Perkin 一 Elmer)。流动相为50%乙 睛层含有十二烷基磺酸钠，加5ml硫酸钠，其PH用1%硫酸调节为4.5。通过速度 为lml/min，检测波长为200nm。高效液相色谱法的优点是如果各种条件都满足的话，重复性好，回收率也很高，其 中a 一茄碱可达93% 士 1.3，而a 一茄碱可达99% 士 3.1。其缺点是受很多种因素 影响，如柱、溶剂的不同都影响其准确度。另外，色谱的流动相对实验的结果也有 影响，而且一该方法所使用的仪器很昂贵，限于实验室中

5、研究时使用。3.酶联免疫结合法酶联免疫结合法的原理是酶标记抗原或抗体，再利用免疫反应去测定抗原或抗体， 其浓度可用酶活力的大小反映出来。Michael等(1983)采用酶联免疫结合法测定龙葵 碱的含量，利用龙葵碱一牛血清蛋白作为抗原有特定的抗血清反应。试验的抗原是 通过高碘酸盐裂解法合成的。将样品或标准品以及龙葵碱一牛血清蛋白加入洞内， 加入免疫抗体，然后于35C保温3小时，加入缓冲液后，4记录最佳的浓度。龙葵 素的浓度通过标准曲线求得。酶联免疫结合法中，马铃薯的预处理很简单，只需将马铃薯组织捣碎均匀并稀释即 可。同时，该方法具有敏感性、特异性的特点，并且有一个很好的终点判断；且该方 法不需要昂贵的仪器。但缺点是获得抗原和抗体所经历的时间较长，同时实验的操 作时间也比较长。四、马铃薯中龙葵碱提取及测定：龙葵碱不溶于水、乙醚和石油醚，可溶于甲醇、乙醇、戊醇、丙酮等。对碱较 稳定，pH大于8时沉淀。经稀酸水解后，可生成茄健和相应的糖（包括葡萄糖、鼠 李糖和半乳糖）。在稀硫酸性环境下，与酸反应生成茄咙。茄咙在酸性环境中与甲醛 溶液作用生成橙红色化合物，在一定范围内，颜色的深浅与茄咙含量成正比

6、。可用 分光光度计在520nm处测定。根据所用的有机溶剂种类和数量的不同，现有的主要方法可分为单溶剂法，双 溶剂法和混合溶剂法等。混合溶剂法所需试剂较贵，同时试验过程中需要昂贵的仪 器，使成本过高。双溶剂法的乙醇一乙酸法和单溶剂法的甲醇法都有一定的优缺点， 乙醇一乙酸法需要的时间比较长，而甲醇法使用的甲醇有毒，且准确度偏低。本试 验利用单溶剂乙醇替代甲醇，结合乙醇一乙酸法的试验流程并改进，比较研究了乙 醇法与乙醇一乙酸法提取马铃薯中龙葵碱的效果。1. 材料与方法1.1试验材料 马铃薯:取适量马铃薯，发芽处理。洗净，组织捣碎机捣碎，混匀。60 C烘干，植物 样品粉碎机粉碎，备用龙葵碱标准品:a 一茄碱，购于sigma公司，纯度）99.8% 1.2仪器与试剂95% 乙醇：AR，GB679 941%硫酸:量取5.65ml浓硫酸，缓缓注入冷水中，于IOOOml容量瓶中定容，摇匀 1%甲醛：量取25ml的甲醛，加入冷水中，于1000ml容量瓶中定容，摇匀 浓氨水:AR，GB631 一 891%氦水：量取45.5ml的浓氨水，加入冷水中，于1000ml容量瓶中定容，摇匀 浓硫酸:AR冰乙酸：AR，

7、GB676 一 90仪器：磁力搅拌器、水浴锅、索氏脂肪提取器、贝克曼分光光度计、圆底烧瓶、直 形冷凝管、电子天平（2009，0.lmg）、组织捣碎机、植物样品微粒粉碎机。2. 提取分离方法乙醇法:称取209的马铃薯鲜样品，将样品和几个玻璃珠（防止加热沸腾）放置于 250ml的圆底烧瓶中，添加100ml的95%乙醇，将圆形烧瓶连接直形冷凝管，放置 于水浴锅，调节温度为85 一 95C，水浴4个小时。冷却，过滤取滤液，回收乙醇 近干，然后将剩余的乙醇倒入蒸发皿中，将乙醇蒸干。用 30ml的5%硫酸溶解剩余 物，过滤，收取滤液，加入浓氨水调节PH值为10 一 10.5，冷却，放置于冰箱过夜。4C, 5000r/min离心，去上清液，用1%氨水洗涤，再离心，洗涤，至洗涤液澄清， 离心，取沉淀即得粗样品。乙醇一乙酸法称取2鲍的烘干马铃薯鲜样品，加100ml乙醇和3ml乙酸，磁力 搅拌器搅拌15分钟，过滤。滤液装入索氏脂肪抽提器的称脂瓶，滤渣用滤纸包住， 放入索氏脂肪提取器的滤纸筒内，水浴抽提16小时后，回收乙醇近干，然后将剩 余的乙醇倒入蒸发皿中，将乙醇蒸干。用30ml的5%硫酸溶解剩余物，过滤

8、，收取 滤液，加入浓氨水调节pH值为1010.5，冷却，放置于冰箱过夜。4C，5000r/min 离心，去上清液，用1%氨水洗涤，再离心，洗涤，至洗涤液澄清，离心，取沉淀 即得粗样品。3. 测定方法龙葵碱标准溶液：精确称取0.0500g龙葵碱，加入1%硫酸溶液溶解，移入50ml 容量瓶中，加入1%硫酸溶液至刻度，摇匀。此溶液每 ml含龙葵碱lmg。标准曲线 的制作:取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准溶液以1%硫酸稀释到2ml，置冰浴中 逐渐加入5ml硫酸(宜于3分钟以上时间滴完)，放置1分钟，然后置冰浴中滴加2.5ml l%甲醛(在2分钟以上时间滴完)，放置90分钟后，于520nm波长测定吸光度。样品的测定:将提取的粗样品用l%硫酸溶解，定容到10ml。取2ml的样品溶液， 与标准曲线的制备同样操作，先预测其大概浓度，再以1%硫酸调节样品浓度，使之每毫升在0.2mg以下，取2ml按标准曲线制备项下操作，于520nm波长测定吸光 度，计算含量。4. 马铃薯中龙葵碱含量的计算公式X (mg/100g) = (P*V*50 ) /m式中x100g样品中所含龙葵碱的量P一测定结果相应的标准浓度(mg/ml)V 一样品提取之后定容总体积(ml) m 一样品量(g)

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