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rna干扰常见问题解答

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卖家[上传人]：cl****1

文档编号：493976412

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常见问题

1、RNA干扰常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的

2、细胞密度就小，如 RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择 24孔板进行优化，比较节省各种试剂。可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM， 50nM，80nM，100nM。转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各 3个浓度。之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。这里需要说明的是, 以荧光信号的强弱判断siRNA转染效果并不准确，最好采用荧光定量 PCR来判断转染效果。因为siRNA转染成功最客观的标志就是基因表达量的减少，另外，细胞本身会吸附荧光染料，会出现非特异性吸附。四、关于用于稀释siRNA与转染试剂的无血清培养基这里是推荐thermo公司的opti-MEM培养基的。能够提高细胞的转染效率的，尤其是在进行脂质体转染的时候是会很大程度上较少细胞毒性作用。五、siRNA转染基因敲除效率的测定方法以及注意事项1. PCR检测mRNA水平的沉默效果，一般推荐在 48h到72h检测，48h比较理想，需要具体的摸索时间。PCR检测沉默效果时，在设计引物的时候最好是将引物设计在沉默位点的两侧，而不是在同侧。这个是由于RNAi引起的沉默是先进行 mRNA的切割之后造成mRNA的降解。另外，即使设计在两侧，也不要离沉默位点太远的地方，不然可能会造成对沉默效果的低估。2. WB检测蛋白蛋白水平的检测，一般在转染后 48h到92h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟你的蛋白的半衰期有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。

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